趙秋伶，史雅靜，張振宇

1. 遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪 117004 2. 遼寧科技學(xué)院電氣與信息工程學(xué)院，遼寧 本溪 117004 3. 遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 葫蘆島 125105

引 言

斑蝥黃(Canthaxanthin，CX) ，又稱β-胡蘿卜素-4,4’-二酮、角黃素等，分子式為C40H52O2[1]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部第2045號(hào)《飼料和飼料添加劑管理?xiàng)l例》，斑蝥黃作為人工合成著色劑，被允許添加進(jìn)家禽飼料中，以改變家禽肉質(zhì)和蛋黃的顏色[2]。普通雞蛋添加斑蝥黃后，蛋黃顏色會(huì)發(fā)生明顯改變，從淺黃色變?yōu)樯约t的橘黃色，并且更加鮮亮[3]。斑蝥黃為橙紅色色素，僅能使蛋黃顏色變美觀，絲毫不會(huì)提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。今年的3·15消費(fèi)者權(quán)益日，央視曝光添加了斑蝥黃的普通雞蛋被拿來(lái)冒充土雞蛋，在各網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)、商場(chǎng)上以高價(jià)售賣(mài)，打著散養(yǎng)雞，精細(xì)喂食，更高飼養(yǎng)成本的旗號(hào)，價(jià)格甚至是普通雞蛋的2倍。這種欺騙行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的合法權(quán)益。斑蝥黃是一種可食用的著色劑，但不代表人體可以大量食用。已有研究表明：過(guò)量的斑蝥黃被人體吸收后累積在視網(wǎng)膜上，造成視力減退等眼疾，嚴(yán)重威脅人體健康[5]。日本于2006年實(shí)施的“肯定列表制度”規(guī)定：禽蛋中斑蝥黃的最大殘留限量為0.1 mg·kg-1，中國(guó)尚無(wú)斑蝥黃殘留限標(biāo)準(zhǔn)[6]。目前，食品中斑蝥黃的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[7]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、反相高效液相色譜法[9-10]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]。盡管這些方法具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在設(shè)備要求高、前處理過(guò)程復(fù)雜、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，無(wú)法普及和推廣。因此，發(fā)展簡(jiǎn)單、低成本、高靈敏度快速檢測(cè)蛋黃中斑蝥黃的方法，對(duì)于消除食品安全隱患具有十分重要的意義。

導(dǎo)數(shù)光譜亦稱微分光譜，是紫外吸收光譜派生的一個(gè)分支，目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高為四階導(dǎo)數(shù)光譜。導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)復(fù)雜組分可不經(jīng)分離而直接測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，近年來(lái)在藥物制劑分析中得到廣泛應(yīng)用[12-13]。食品安全分析由于對(duì)靈敏度要求比較高，導(dǎo)數(shù)光譜法經(jīng)常無(wú)法滿足要求。但斑蝥黃作為著色劑添加到蛋黃中的量是非?？捎^的，有文獻(xiàn)報(bào)道：普通雞蛋每100 g干蛋黃粉中總類胡蘿卜素含量為4.5 mg；而色度達(dá)到15的紅心蛋每100 g干蛋黃粉中總類胡蘿卜素含量高達(dá)9.25 mg[14]。蛋黃中含水量在48%左右，那么色度15的紅心蛋中斑蝥黃的添加量為每100 g蛋黃中斑蝥黃含量約2.47 mg，如此大含量的斑蝥黃用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可以滿足測(cè)量要求。

本文將紫外-可見(jiàn)分光光度法與一階導(dǎo)數(shù)光譜法有機(jī)結(jié)合，解決了斑蝥黃和蛋黃提取液兩者吸收光譜嚴(yán)重重疊而引起的干擾問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中斑蝥黃的快速、靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TU-1900雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；BSA224S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Heal Force臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(力康生物科技公司)；LX-400迷你離心機(jī)(其林貝爾儀器制造有限公司)；THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)。

新鮮雞蛋(市售)；斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉試劑公司；甲醇、乙醇、乙腈、石油醚和氯仿等(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 樣品前處理及標(biāo)準(zhǔn)液的配制

新鮮雞蛋敲開(kāi)，分出蛋清保留蛋黃部分，用玻璃棒攪拌均勻，量出體積。以體積比為3∶1的乙醇和氯仿混合溶劑作為提取劑，料液比為1∶4，在室溫條件下進(jìn)行提取，離心分離，每次提取5 min，提取3次，提取液用化學(xué)定性分析濾紙過(guò)濾一次。

斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)品 5 mg，用氯仿溶解并定容至5 mL，配成濃度為1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用前用乙醇和氯仿混合溶劑稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，保證最終溶液里乙醇和氯仿體積比為2∶1，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 檢測(cè)方法及數(shù)據(jù)處理

量取提取液體積，運(yùn)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為200～800 nm 范圍內(nèi)，光譜帶寬 1 nm，間隔1 nm 的條件下進(jìn)行光譜掃描。掃描前兩次校正基線，第一次用空氣校正，第二次用體積比為3∶1的乙醇和氯仿的混合溶劑校正。

獲得的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，運(yùn)用Origin軟件對(duì)其求一階導(dǎo)數(shù)，并使用Adjacent-Averaging方法對(duì)一階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行平滑處理。確定測(cè)量斑蝥黃含量的波長(zhǎng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

1.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

選取新鮮雞蛋蛋黃(已驗(yàn)證無(wú)斑蝥黃)作為添加回收實(shí)驗(yàn)樣品。前處理方法：稱取均質(zhì)后蛋黃液3份，每份各1.000 mL ，置于3個(gè)15 mL離心管中，分別添加1.000，3.000和5.000 μg斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)品，靜置10 min后分別加入4 mL體積比為3∶1的乙醇和氯仿的混合溶劑，充分振蕩均勻，室溫提取5 min，然后以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，分出提取液。提取3次，合并提取液。提取液用化學(xué)定性分析濾紙過(guò)濾一次，保留待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件的確定

蛋黃中的色素主要包括葉黃素和玉米黃素，還含有少量黃體素、胡蘿卜素及核黃素等。葉黃素、玉米黃素和斑蝥黃均為線性多烯分子、且分子量接近，相似的結(jié)構(gòu)使得它們通常被同時(shí)被提取、很難分離[15]。但它們各自的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：葉黃素和玉米黃素為含有羥基的黃色系類胡蘿卜素；而斑蝥黃是含有羰基的紅色系類胡蘿卜素。又使得它們?cè)诓煌軇┲械娜芙饽芰Σ煌?。為了便于肉眼觀察蛋黃色素提取效率，試圖尋找一種能同時(shí)提取蛋黃色素和斑蝥黃的溶劑。為了提取蛋黃中天然色素，分別選用甲醇、乙醇、乙腈、石油醚和氯仿作為溶劑，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乙醇能最快最大量的將蛋黃色素萃取出來(lái)。同時(shí)試驗(yàn)了斑蝥黃在甲醇、乙醇、乙腈、石油醚和氯仿中的溶解度，發(fā)現(xiàn)斑蝥黃在氯仿中溶解能力最強(qiáng)。選用乙醇和氯仿的混合溶劑作為蛋黃色素提取劑。因氯仿環(huán)境毒性較大，盡量少用的原則，考察了混合提取劑中氯仿的最小用量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氯仿的體積含量至少為四分之一時(shí)，提取效率滿足要求。當(dāng)用混合提取劑處理蛋黃液時(shí)，蛋黃即時(shí)褪色，每次提取時(shí)間5分鐘足夠，蛋黃中的天然色素和斑蝥黃均為線性多烯結(jié)構(gòu)，容易發(fā)生氧化，提取溫度不宜高，選擇室溫且提取出來(lái)的色素低溫避光保存，避免發(fā)生氧化。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

三次蛋黃提取液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖1中曲線a，b，c，不同濃度斑蝥黃的紫外-可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖1中曲線d，e，f，蛋黃提取液和斑蝥黃兩者的吸收光譜在波長(zhǎng)280～600 nm范圍內(nèi)嚴(yán)重重疊，因此無(wú)法采用傳統(tǒng)紫外-可見(jiàn)分光光度法直接測(cè)定蛋黃中斑蝥黃含量。蛋黃提取液和斑蝥黃，盡管兩者的紫外-可見(jiàn)吸收光譜嚴(yán)重重疊，但是振幅和最大吸收峰位置有差別：蛋黃提取液最大吸收強(qiáng)度在520 nm，而斑蝥黃的最大吸收強(qiáng)度在580 nm；蛋黃提取液的最大吸收峰位于448 nm，而斑蝥黃的最大吸收峰和蛋黃提取液的最大吸收峰的亞峰重合，位于474 nm。振幅和吸收峰位置的微小差別使得可以采用導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理以消除蛋黃提取液對(duì)斑蝥黃檢測(cè)的干擾。

圖1 蛋黃提取液和斑蝥黃的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

通過(guò)一階導(dǎo)數(shù)光譜法處理圖1的6條譜線，得到一階導(dǎo)數(shù)光譜如圖2。由圖2中曲線a，b，c可知：在波長(zhǎng)448，467，474和520 nm處三次蛋黃提取液的一階導(dǎo)數(shù)光譜交叉于0點(diǎn)，在520 nm后蛋黃提取液的一階導(dǎo)數(shù)光譜與基線重合、無(wú)吸收；由圖2中曲線d，e，f可知：不同濃度斑蝥黃的一階導(dǎo)數(shù)光譜在波長(zhǎng)474及580 nm處交叉于0點(diǎn)，580 nm后無(wú)吸收。綜合分析發(fā)現(xiàn)：斑蝥黃和蛋黃提取液混合物的一階導(dǎo)數(shù)光譜在474 nm都交叉于0點(diǎn)，在448，467及520～579 nm處蛋黃提取液的一階導(dǎo)數(shù)光譜交叉于0點(diǎn)，而斑蝥黃的一階導(dǎo)數(shù)光譜值處于非0交叉點(diǎn)。當(dāng)在某一波長(zhǎng)時(shí)：物質(zhì)(一)的一階導(dǎo)數(shù)光譜交叉于0點(diǎn)，而物質(zhì)二的一階導(dǎo)數(shù)光譜處于非0交叉點(diǎn)，此波長(zhǎng)下兩者混合物的一階導(dǎo)數(shù)光譜值與物質(zhì)一無(wú)關(guān)，只與物質(zhì)(二)濃度正相關(guān)。因此，448，467及520～579 nm可作為斑蝥黃的檢測(cè)波長(zhǎng)。蛋黃提取液除了包含葉黃素和玉米黃素等天然色素外，還含有其他易溶于溶劑的蛋黃組分，蛋黃提取液為多種物質(zhì)的混合物，但可以掃出吸收光譜，蛋黃提取液和斑蝥黃的吸收光譜的振幅和吸收峰存在微小差異可以采用導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)所得光譜進(jìn)行處理以消除蛋黃提取液中色素對(duì)斑蝥黃檢測(cè)的干擾，實(shí)現(xiàn)不分離情況下的快速檢測(cè)。

圖2 蛋黃提取液和斑蝥黃的一階導(dǎo)數(shù)光譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限

通過(guò)對(duì)斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)系列的光譜掃描曲線[見(jiàn)圖3(a)]進(jìn)行一次微分得一階導(dǎo)數(shù)光譜[見(jiàn)圖3(b)]，利用此光譜獲得一階導(dǎo)數(shù)光譜曲線上448，467，520和535 nm處的特征值。以斑蝥黃的濃度為橫坐標(biāo)，以一階導(dǎo)數(shù)光譜絕對(duì)值為縱坐標(biāo)，建立工作曲線，見(jiàn)圖4(a)。在0～18 μg·mL-1范圍內(nèi)四條曲線均符合線性關(guān)系，回歸方程和線性系數(shù)見(jiàn)圖4(b)。按照IUPAC建議，根據(jù)空白溶液基線噪聲信號(hào)的3倍(3δ評(píng)判標(biāo)準(zhǔn))對(duì)應(yīng)的待分析物的濃度，四條直線的檢出限分別為2.03，1.12，0.58和1.35 μg·mL-1。520 nm波長(zhǎng)下的一階導(dǎo)數(shù)光譜對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率最大、線性系數(shù)較高、檢出限最低。因此520 nm條件下可獲得最優(yōu)工作曲線，以此進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 (a)含斑蝥黃的蛋黃提取液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜；(b)為(a)的一階導(dǎo)數(shù)光譜

2.4 樣品的添加回收測(cè)定

分別來(lái)自不同養(yǎng)殖場(chǎng)的三個(gè)新鮮雞蛋樣本，首先按照建立的方法進(jìn)行斑蝥黃含量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：被檢的雞蛋樣本不含有斑蝥黃。用此不含斑蝥黃的雞蛋樣本做添加回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，樣品的回收率在96.4%～102.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.53%～5.67%之間，說(shuō)明建立的方法能檢測(cè)蛋黃中殘留的斑蝥黃，并且檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合檢測(cè)要求。

線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2448 nmY=0.000 658 1C-0.000 552 90.990 0467 nmY=0.000 290 3C+0.001 2600.994 2520 nmY=0.001 010C+0.000 180 90.992 9535 nmY=0.000 742C-0.000 067 140.990 1

3 結(jié) 論

基于紫外-可見(jiàn)吸收光譜及一階導(dǎo)數(shù)光譜技術(shù)，構(gòu)建了蛋黃中斑蝥黃殘留的快速檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)蛋黃提取液和斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理，根據(jù)兩者一階導(dǎo)數(shù)光譜0及非0交叉點(diǎn)的位置特征，確定斑蝥黃檢測(cè)波長(zhǎng)為448，467及520～579 nm，根據(jù)工作曲線的線性關(guān)系和檢測(cè)限，最終確定520 nm為最優(yōu)檢測(cè)波長(zhǎng)。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條下，斑蝥黃的一階導(dǎo)數(shù)光譜絕對(duì)值與斑蝥黃濃度在0～17.68 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限0.58 μg·mL-1。為了驗(yàn)證該方法在實(shí)際樣品中的檢測(cè)效果，取三個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的雞蛋樣本進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率在96.4%～102.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.53%～5.67%，說(shuō)明建立的方法能檢測(cè)蛋黃中殘留的斑蝥黃，并且檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合檢測(cè)要求。這種方法無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理、無(wú)需大型儀器設(shè)備，且靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、檢測(cè)時(shí)間短，建議在食品安全分析中廣泛推廣和使用。

表1 樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 1 Standard-added recovery experiments of the samples (n=5)