相 纓，馮安迪，趙正卓，孫叢丹，徐浩朋，孫立娜，謝鳳英, 3*

1. 東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030 2. 東北農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，黑龍江 哈爾濱 150030 3. 哈爾濱市食品產業(yè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028

引 言

花色苷(anthocyanins)是由花青素通過糖苷鍵與一個或多個糖苷配體(主要包括葡萄糖苷、半乳糖苷、鼠李糖苷和阿拉伯糖苷等)結合而成的一類天然水溶性色素[1]。由于花色苷的極性較強，通常不會被細胞直接吸收而進入人體的循環(huán)系統(tǒng)。已有的研究表明，花色苷總攝入量的5%～10%是在小腸中被人體吸收的，大部分的花色苷物質(占總攝入量的90%～95%)會積聚在大腸腔內，與其他結合物一起被排泄到腸腔，最終在結腸微生物菌群作用下被分解為一系列可吸收的低分子量花色苷代謝產物[2-3]。因此，花色苷生物利用度的提高是花色苷生物活性發(fā)揮的重要條件。花色苷的生物利用度與其結構的復雜程度和聚合形式是密切相關的，通常低分子量(如單體和二聚體)或能以完整結構到達結腸的低聚物(如分子量在40 000 Da的縮合或可水解的單寧)都極易被人體所吸收[4]。

黃烷醇化合物是一類以無色矢車菊甙元、無色天竺葵甙元或無色飛燕草甙元為主要結構框架的多酚類物質，其在葡萄酒陳釀和貯藏期間易與花色苷發(fā)生反應形成二聚體結構，而改善葡萄酒的澀感強弱和顏色穩(wěn)定性[5]。因此，人工模擬葡萄酒陳釀時期環(huán)境，亦即在微量乙醛存在的酸性條件下，利用乙醛本身可作為“共聚劑”的特性[6]促使黃烷醇化合物(兒茶素)和黑米中的花色苷發(fā)生縮合反應化學合成花色苷復合物(見圖1)以期改善黑米花色苷的生物利用度。

紅外光譜(FTIR)是利用有機物分子結構中不同的化學鍵和官能團吸收頻率不同來獲得分子特征官能團的結構信息進而實現(xiàn)對花色苷分子結構的鑒定[7]。在兒茶素和黑米花色苷縮合反應合成的復合物結構中因“乙基橋”的存在，將會在紅外光譜—CH3反對稱變形和—CH2變形振動譜區(qū)[(1 460±10) cm-1]出現(xiàn)新的吸收峰。因此，按照峰區(qū)指認各譜帶的歸屬并結合指紋區(qū)的譜帶特征，可以實現(xiàn)對兒茶素-花色苷復合物這一花色苷二聚體結構的快速檢測。

圖1 乙醛介導兒茶素-花色苷復合物的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of catechin-anthocyanin complex mediated by acetaldehyde

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

黑米購買于黑龍江省五谷信合生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司，產地為黑龍江省哈爾濱市通河縣。兒茶素(≥98%)購買于上海源葉生物科技有限公司。AB-8大孔吸附樹脂購買于天津海光化工有限公司。所用試劑均為色譜純或分析純。

1.2 黑米花色苷的提取和純化[8-9]

原料黑米經粉碎、篩分后放于燒杯中，按料液比1∶10(W/V)的比例加入50%乙醇溶液，于30 ℃條件下水浴攪拌提取2 h，所得樣液經抽濾、旋轉蒸發(fā)去除乙醇。按100 mL黑米花色苷提取液加10 mg吸附劑的比例加入活化后的AB-8大孔樹脂，于室溫在轉速為100 r·min-1的條件下進行24 h吸附處理。其后，吸附了花色苷的大孔樹脂經過濾、去離子水洗滌2次后，加入70%乙醇溶液(含有1%鹽酸)進行24 h解析處理，所得解析液經旋轉蒸發(fā)、濃縮、冷凍干燥即為黑米花色苷樣品。

1.3 兒茶素-黑米花色苷復合物的制備

黑米花色苷樣品和兒茶素標準品配制成濃度為1 mg·mL-1的工作液，乙醛溶液濃度調整至4.55×10-2mol·L-1。其后，在具塞三角瓶中分別加入同體積的上述工作液，并用色譜級甲酸調整pH值至3.2。同時，以同濃度黑米花色苷溶液為試驗空白對照組，將其放于25 ℃的溫度條件下震蕩反應24 h。所得樣液經旋轉蒸發(fā)、濃縮、冷凍干燥后，待測。

1.4 紅外光譜分析

將兒茶素-黑米花色苷復合物和黑米花色苷樣品分別與溴化鉀混合均勻后壓片，利用Spectrum GX型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)進行紅外光譜分析。其光譜范圍為4 000～500 cm-1，分辨率2 cm-1，掃描信號累加次數(shù)為32次，掃描時扣除了水和二氧化碳的干擾。

1.5 兒茶素-黑米花色苷復合物熱力學參數(shù)的測定

1.5.1 樣品的處理

將濃度為1 mg·mL-1兒茶素-黑米花色苷復合物溶液與等體積pH 3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合均勻分裝于具塞試管中，其后將其分別放置于40，50，60，70和80 ℃的水浴鍋中加熱4 h進行熱處理，并測定其于波長520 nm處的吸光度值。

1.5.2 熱力學參數(shù)的計算

參考文獻[10]的方法，應用一級動力學模擬不同條件下兒茶素-黑米花色苷復合物的降解，并根據動力學方程計算出不同溫度下兒茶素-黑米花色苷復合物的焓變ΔH(kJ·mol-1)、吉布斯自由能ΔG(kJ·mol-1)和熵ΔS[kJ·(mol·K)-1]。

1.6 數(shù)據的處理

每組實驗進行3次平行，利用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0對數(shù)據進行差異顯著性分析，利用Origin 8.6軟件進行作圖。

2 結果與討論

2.1 兒茶素-黑米花色苷復合物的紅外光譜圖

2.2 兒茶素-黑米花色苷復合物的熱力學參數(shù)的測定結果

兒茶素-黑米花色苷復合物熱力學參數(shù)測定結果如表2所示。ΔH代表反應物化學鍵的強弱程度，ΔH越小，其能量勢壘越低而利于活化復合物的形成[14]。兒茶素-黑米花色苷復合物在不同溫度下的ΔH均為正值，表明兒茶素和黑米花色苷之間的縮合反應為吸熱反應。ΔG代表反應物的能量和活化狀態(tài)之間的差異，通常被當作反應過程是否為自發(fā)的判定標準[15]。兒茶素-黑米花色苷復合物的ΔG為正值，表明兒茶素和黑米花色苷之間的結合過程為非自發(fā)的反應。ΔS代表反應體系中分子混亂程度，亦即反映反應系統(tǒng)到其自身熱力學平衡的距離。ΔS較低意味著物質剛剛通過了初始結構的某種物理或化學重排，使其處于了接近其自身熱力學平衡的狀態(tài)。表2中ΔS均為負值，表明活化復合物的結構自由度低于反應物，其初始系統(tǒng)和熱力學平衡之間的距離縮短了，兒茶素和黑米花色苷縮合所形成的兒茶素-黑米花色苷復合物結構趨于穩(wěn)定。

圖2 兒茶素-黑米花色苷復合物的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of Catechin-black rice anthocyanin complex

表1 兒茶素-黑米花色苷復合物紅外光譜特征峰的歸屬[11-12]Table 1 Characteristic peaks of infrared spectra of catechin-black rice anthocyanin complex

表2 兒茶素-黑米花色苷復合物的熱力學參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of Catechin-black rice anthocyanin complex

3 結 論

利用紅外光譜法對兒茶素-黑米花色苷復合物縮合反應機制進行解析時，根據復合物結構中出現(xiàn)的新官能團乙基(—CH2CH3)的特征吸收峰，按照峰區(qū)指認各譜帶的歸屬并結合指紋區(qū)的有關譜帶，即可構建出兒茶素-黑米花色苷復合物特征結構。同時，結合熱力學參數(shù)的測定結果，確定兒茶素和黑米花色苷之間的縮合反應為吸熱、非自發(fā)反應，其縮合反應產物兒茶素-黑米花色復合物具有較低的自由度和穩(wěn)定的結構。由此可見，紅外光譜法結合熱力學參數(shù)的評價模式可以對具有特定官能團的花色苷聚合物進行快速、準確、有效的評價。