朱林慧，方小英，段慧娟，徐 蕾，楊振德

（廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西南寧 530004）

云斑白條天牛（Batocera lineolata）為天?？疲–erambycidae）多食性昆蟲，主要危害枇杷（Eriobotrya japonica）、無(wú)花果（Ficus carica）、柑橘（Citrus reticulata）、烏木（Echeveria agavoides'Ebony'）、泡桐（Paulownia fortunei）、蘋果（Malus pumila）、桃（Amygdalus persica）和核桃（Juglans regia）等[1]。其分布范圍廣，繁殖能力強(qiáng)，適應(yīng)性強(qiáng)，是短周期用材林和經(jīng)濟(jì)林的重要蛀干害蟲[2-3]。在中國(guó)，云斑白條天牛有害生物風(fēng)險(xiǎn)性PRA值為2.04，屬于高度危險(xiǎn)性林業(yè)有害生物[1]。

昆蟲的腸道中存在著大量微生物，這些微生物與昆蟲聯(lián)系廣泛[4]。一些微生物與昆蟲宿主在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化中形成了緊密的共生關(guān)系[5]。昆蟲為腸道微生物提供穩(wěn)定的生存環(huán)境和必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，腸道微生物參與昆蟲體內(nèi)的多種代謝過(guò)程，在昆蟲的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫等諸多生理功能上發(fā)揮重要作用[6-7]。李丹紅等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同類型白蟻的腸道細(xì)菌均在白蟻取食木材后幫助其對(duì)木材進(jìn)行降解。蚜蟲共生菌（Buchnera）能產(chǎn)生多種氨基酸，彌補(bǔ)蚜蟲單一吸食植物汁液導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)不足[9]。

周峻沛[10]利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法從云斑白條天牛幼蟲的腸道內(nèi)分離出100 株細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）、拉烏爾菌屬（Raoultella）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）為其優(yōu)勢(shì)菌屬。謝谷艾等[11]分離與鑒定了松褐天牛（Monochamus alternatus）幼蟲腸道微生物，發(fā)現(xiàn)固氮菌在松褐天牛幼蟲腸道中普遍存在。陳金華[12]利用常規(guī)16S rDNA 克隆文庫(kù)和RFLP 分析，發(fā)現(xiàn)桑粒肩天牛（Apriona germari）幼蟲腸道中有豐富的微生物，優(yōu)勢(shì)菌屬為克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus）。目前，關(guān)于云斑白條天牛具體齡級(jí)幼蟲腸道微生物尚未有報(bào)道，不同齡級(jí)間腸道微生物差異還需進(jìn)一步研究。云斑白條天牛4齡幼蟲生長(zhǎng)速度最快，取食量大，是控制其生長(zhǎng)與危害的關(guān)鍵時(shí)期，研究此齡期的腸道微生物尤為重要。本研究采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)合16S rDNA 基因測(cè)序的方法，對(duì)云斑白條天牛4齡幼蟲腸道內(nèi)的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離與鑒定，為運(yùn)用生物防治云斑白條天牛的新技術(shù)提供可利用的微生物資源，也為云斑白條天牛具體齡級(jí)幼蟲腸道共生菌的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

2018年5—6月上旬，在廣西國(guó)有高峰林場(chǎng)六里分場(chǎng)（108°20'E，22°58'N）的桉樹林中采集云斑白條天牛4 齡幼蟲，作為樣品。該地年均相對(duì)濕度80%以上，年均氣溫19.3 ℃。

1.1.2 主要器材及試劑

主要器材為昆蟲針、解剖剪、鑷子、蠟盤、玻璃勻漿器、涂布器、接種環(huán)、高壓蒸汽滅菌鍋、高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）、電子天平、垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）、博迅BSC-400 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒（天根DP302）、Life Touch PCR、Nanodrop 2000 可見(jiàn)分光光度計(jì)和DYY-8C 電泳儀等。在南寧市羽瑞生物試劑經(jīng)營(yíng)部購(gòu)買培養(yǎng)基原料、細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒和其他分析純?cè)噭?，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物?7F 和1492R）。LB 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方參考萬(wàn)倫[13]的配制方法，將10 g 蛋白胨、10 g NaCl、5 g 酵母膏和18 g 瓊脂用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min。去掉瓊脂后得到LB 液體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 云斑白條天牛幼蟲腸道的提取

參考周峻沛[10]的方法進(jìn)行解剖。所有操作均在紫外殺菌過(guò)的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，所用器械均進(jìn)行高壓滅菌或75%酒精消毒。取健康的云斑白條天牛4 齡幼蟲放入4 ℃冰箱30 min，使其活動(dòng)能力減弱，用無(wú)菌水沖洗蟲體表面雜質(zhì)，再用75%酒精沖洗并浸泡3 min，隨后用無(wú)菌水沖洗3 次。在蠟盤上用昆蟲針固定蟲體，用解剖剪將蟲體剪開，用鑷子取出腸道，將腸道上連帶的脂肪等無(wú)關(guān)物質(zhì)用無(wú)菌水沖洗并用鑷子撥離后放入勻漿器中，加入1 mL無(wú)菌水充分研磨，制成幼蟲腸道勻漿液。

1.2.2 腸道細(xì)菌的分離和純化

將制好的腸道勻漿液在4 ℃、4 000 rpm 條件下離心10 s，取上清液，用無(wú)菌水梯度稀釋103、104和105倍，分別取不同倍數(shù)的勻漿液各100 μL，均勻涂布在LB 培養(yǎng)基上，每種稀釋倍數(shù)重復(fù)3 次，以無(wú)菌水涂布及消毒后的云斑白條天牛幼蟲在平板上滾動(dòng)摩擦后的平板為對(duì)照（CK）。在27 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，長(zhǎng)出菌落后，用接種環(huán)從每種稀釋梯度的培養(yǎng)基上挑取大小、形態(tài)和顏色有差異的單菌落，在新的LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行數(shù)次4 區(qū)劃線分離，直至得到純的單克隆菌株。將純的單克隆菌株接種到LB 液體培養(yǎng)基中，加入25%的甘油后，放置冰箱（-80 ℃）貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)菌鑒定

對(duì)分離純化得到的菌株進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀鑒定、染色反應(yīng)和生理生化特性鑒定，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[14]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]進(jìn)行判定。

將分離純化得到的單克隆菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，取2 mL細(xì)菌懸液，11 500 r離心1 min，倒去上清液，使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（操作步驟按說(shuō)明進(jìn)行）分別提取所有試驗(yàn)菌株的總DNA，所提取DNA的OD260/OD280比值使用Nanodrop 2000 可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，繼而確定DNA 純度和濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶是否可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增以提取出來(lái)的各細(xì)菌DNA為模板，以細(xì)菌通用引物為擴(kuò)增引物，即正向引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3’）和反向引物1492R（5’-GGTTACCTTGT-TACGACTT-3’）。PCR反應(yīng)體系為12.5μLMix，1.0μL27F（10mmol/L）和1.0μL1492R（10mmol/L），1.0μLDNA模板（50ng/μL）12.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性條件95℃5min；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的條件94℃30s，56℃30 s，72 ℃1 min；終末延伸條件72 ℃10 min；最后4 ℃條件下保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，利用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若檢測(cè)合格，送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA 基因測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI 平臺(tái)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行Nucleotide BLAST序列比對(duì)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中與測(cè)試菌株序列同源性最高的序列確定菌株的分類，并利用MEGA 7.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

通過(guò)對(duì)云斑白條天牛幼蟲體內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與純化，共獲得14株不同的單克隆菌株（表1）。將14株菌株劃線接種到LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天后，進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，根據(jù)染色結(jié)果，10 株菌株革蘭氏反應(yīng)為陰性，4 株為陽(yáng)性。使用油鏡觀察后發(fā)現(xiàn)11 株菌株形態(tài)呈桿狀，3 株呈球狀；5 株菌株有柱狀芽孢，9 株沒(méi)有；7 株菌株有周生鞭毛，1 株有端生鞭毛，1株有側(cè)生鞭毛，5株沒(méi)有鞭毛；5株菌株有莢膜，9株沒(méi)有。

表1 云斑白條天牛幼蟲腸道可培養(yǎng)細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀Tab.1 Morphology and culture characteristics of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae

2.2 生理生化

對(duì)14株菌株進(jìn)行不同的碳素化合物、氮素化合物和酶的生理生化特性鑒定，14株菌株屬于糖、醇類發(fā)酵型，且不產(chǎn)生色氨酸脫氨酶、苯丙氨酸脫氨酶和吲哚；除N11菌株外，其余菌株均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶；除N5菌株外，其余菌株V-P試驗(yàn)均為陰性反應(yīng)（表2）。

表2 云斑白條天牛幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的生理生化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae

續(xù)表2 Continued

2.3 可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA 基因序列分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)合RDP數(shù)據(jù)庫(kù)Classifier分析，14種細(xì)菌分屬于9個(gè)屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、拉烏爾菌屬、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、Gibbsiella和Kosakonia（表3）。其中，芽孢桿菌屬2株（N6和N8），腸球菌屬2株（N7和N11），腸桿菌屬1 株（N14），檸檬酸桿菌屬2 株（N2 和N10），拉烏爾菌屬3 株（N4、N5 和N13），蒼白桿菌屬1 株（N3），寡養(yǎng)單胞菌屬1 株（N1），Gibbsiella1株（N9），Kosakonia1株（N12）。

表3 云斑白條天牛幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA 序列比對(duì)結(jié)果Tab.3 16S rDNA sequence identification results of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae

2.4 可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序得到的云斑白條天牛4齡幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，其腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌可歸類于9 個(gè)屬，5個(gè)科，分別在進(jìn)化樹上形成獨(dú)立的分支（圖1）。其中，N14、N1、N2、N10、N9、N4、N5、N13和N12形成以變形菌門的γ-變形菌綱（γ-proteobacteria）為家族的大分支，除N1 屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的寡養(yǎng)單胞菌屬外，其余均屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、Gibbsiella、拉烏爾菌屬和Kosakonia；N3 獨(dú)自形成以變形菌門（Proteobacteria）的α-變形菌綱（α-proteobacteria）為家族的分支，為布魯氏菌科（Brucellaceae）的蒼白桿菌屬；N6、N8、N7 和N11 形成以厚壁菌門（Firmicutes）為家族的分支，均為芽孢桿菌綱（Bacilli），分別屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）的芽孢桿菌屬和腸球菌科（(Enterococcaceae）的腸球菌屬。系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步支持了RDP Classiffier的分類結(jié)果。

圖1 基于16S rDNA序列的云斑白條天牛幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of culturable bacteria in intestinal tracts of B.lineolata larvae based on 16S rDNA sequences

3 結(jié)論與討論

本研究采用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)的方法從云斑白條天牛4 齡幼蟲腸道內(nèi)分離和純化出14 種細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)觀察并結(jié)合16S rDNA 基因測(cè)序技術(shù)，鑒定出這14種可培養(yǎng)細(xì)菌分屬于寡養(yǎng)單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、蒼白桿菌屬、拉烏爾菌屬、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、Gibbsiella和Kosakonia。其中，變形菌門的拉烏爾菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。

本研究顯示，14株細(xì)菌中有10株歸類于變形菌門，4 株歸類于厚壁菌門，說(shuō)明在門水平上，變形菌門是云斑白條天牛4齡幼蟲腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群。已有研究發(fā)現(xiàn)，鞘翅目（Coleoptera）昆蟲中，光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）[16]、暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）[17]和新西蘭助翅鰓金龜（Costelytra zealandica）幼蟲[18]的腸道優(yōu)勢(shì)菌均為變形菌門和厚壁菌門。鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲中的稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinawlis）[19]、舞毒蛾（Lymantria dispar）[20]、小菜蛾（Plutella xylostella）[21]以及雙翅目（Diptera）的南亞果實(shí)蠅（Bactrocera tau）[22]和柑橘大實(shí)蠅（Ceratitis capitata）[23]的腸道優(yōu)勢(shì)菌也均為厚壁菌門和變形菌門。說(shuō)明變形菌門與厚壁菌門是不少昆蟲體內(nèi)微生物的優(yōu)勢(shì)菌門，它們可能對(duì)昆蟲體內(nèi)的生理代謝活動(dòng)有重要影響。

云斑白條天牛4齡幼蟲體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬為拉烏爾菌屬，其次是芽孢桿菌屬、腸球菌和檸檬酸桿菌屬等。有研究發(fā)現(xiàn)，拉烏爾菌屬中的很多種類具有降解多種環(huán)境污染物的作用，昆蟲腸道內(nèi)的拉烏爾菌可能有助于昆蟲的抗藥性[24]。室內(nèi)飛蝗（Locusta migratoria）種群相比于田間飛蝗種群，其后腸細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌（拉烏爾菌屬）所占比例有所下降，這可能是野外昆蟲抗藥性相對(duì)較強(qiáng)的原因之一[25]。芽孢桿菌屬為嚴(yán)格好氧或兼性厭氧菌[26]，可消耗腸道內(nèi)氧氣，使其形成厭氧環(huán)境，為有益微生物（乳酸桿菌等）的生長(zhǎng)提供良好環(huán)境，且有較強(qiáng)的分泌胞外酶的能力和豐富的代謝產(chǎn)物[27]。腸球菌在很多昆蟲腸道微生物中均有發(fā)現(xiàn)，相輝等[28]發(fā)現(xiàn)家蠶（Bombyx mori）幼蟲腸道微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌群為腸球菌，其豐度高達(dá)82%；魯興萌等[29]研究發(fā)現(xiàn)在家蠶腸道中起著抵御病原微孢子蟲發(fā)芽增殖作用的是優(yōu)勢(shì)菌（腸球菌）。檸檬酸桿菌屬常在雙翅目昆蟲中分布，橘小實(shí)蠅（bactrocera dorsails）[30]和南亞實(shí)蠅（Bactrocera tau）[31]的優(yōu)勢(shì)菌屬均為檸檬酸桿菌屬，該類細(xì)菌為化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型，可利用糖酵解與戊糖磷酸途徑降解碳水化合物[32]。云斑白條天牛幼蟲體內(nèi)相同的菌群是否具有相似的功能還需做進(jìn)一步研究。

昆蟲體內(nèi)微生物多樣性主要受昆蟲性別、發(fā)育齡期和種群等方面的影響[33]。暗黑鰓金龜幼蟲腸道微生物多樣性在不同齡期存在差異，其1 齡幼蟲的優(yōu)勢(shì)菌門（擬桿菌門（Bacteroidetes））的豐度最高；在第2 和3 齡幼蟲中，厚壁菌門的豐度最高[34]。周峻沛[10]從江西省上饒市蟲齡不一的云斑白條天牛幼蟲胃腸道中分離和鑒定出100 株細(xì)菌，分別歸類于5個(gè)門、13 個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門和厚壁菌門，優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬、拉烏爾菌屬和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）。本研究結(jié)果中云斑白條天牛4 齡幼蟲腸道內(nèi)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門與周峻沛的結(jié)果一致。在屬的水平上，雖然均發(fā)現(xiàn)拉烏爾菌屬為云斑白條天牛幼蟲的優(yōu)勢(shì)菌屬，但本研究未發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬類型，分離鑒定出的細(xì)菌種類也較少。這可能與云斑白條天牛幼蟲的蟲齡、寄主、采集地和采集時(shí)間等的不同有關(guān)。周峻沛的采集地點(diǎn)為江西上饒，與廣西南寧處于不同緯度，在氣候、地形和溫度等方面均存在差異。俞英豪[35]分別對(duì)采集于江蘇南京和浙江永康的大青葉蟬（Cicadella viridis）進(jìn)行腸道細(xì)菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)兩地葉蟬的腸道菌群存在明顯差異。陳金華[12]對(duì)桑粒肩天牛幼蟲的腸道多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同月份間細(xì)菌多樣性不同。據(jù)此推測(cè)不同采集時(shí)間導(dǎo)致溫度和濕度的不同，進(jìn)而影響云斑白條天牛腸道的細(xì)菌組成。本研究中云斑白條天牛的寄主為桉樹，周峻沛研究的云斑白條天牛寄生于櫟屬（Quercus）植物。相對(duì)于櫟屬植物，桉樹木屑成分主要為木質(zhì)素，含氮量少[36]，膳食基質(zhì)的組成和含量對(duì)昆蟲腸道細(xì)菌的豐度有一定影響[37]，所以取食不同寄主的云斑白條天牛腸道微生物多樣性有差異。

很多因素影響昆蟲體內(nèi)微生物的組成與豐度，系統(tǒng)探討造成云斑白條天牛腸道細(xì)菌差異的因素對(duì)于闡明云斑白條天牛幼蟲腸道細(xì)菌的功能、開發(fā)基于腸道細(xì)菌為靶標(biāo)的生物防治藥劑具有重要意義。