王曉春，張健，張延鵬，毛莉蓉

(安徽理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南，232000)

結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)是一種普遍用于結(jié)核病篩查和臨床診斷的傳統(tǒng)方法，然而TST的某些局限性問題尚未解決，尤其是TST與大多數(shù)環(huán)境非結(jié)核分枝桿菌和卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株的交叉反應(yīng)性而出現(xiàn)的低特異性問題[1-2]。在目前全球卡介苗普遍接種的大背景下，TST陽性不能有效區(qū)分是受到結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染，還是BCG接種引起的免疫反應(yīng)，這使得TST在結(jié)核分枝桿菌感染中的應(yīng)用受到了巨大的限制。除此之外，TST陽性隨患者免疫力下降或缺陷而逐漸減弱甚至消失，其中最具有代表性的一類人群就是合并肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，TB)感染的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency syndrome，HIV)患者。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)HIV感染者對TST的反應(yīng)明顯低于未感染HIV者，在合并結(jié)核菌潛伏感染(latent TB infection，LTBI)的HIV人群中使用TST檢測對HIV患者的LTBI的輔助診斷有局限性。

相較于TST試驗(yàn)的限制性，γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)在輔助診斷結(jié)核分枝桿菌感染具有較高的特異性。IGRA是利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激人外周血T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素釋放情況來判斷患者是否為結(jié)核分枝桿菌感染的試驗(yàn)。但是結(jié)核分枝桿菌抗原的免疫原性和毒力不盡相同，結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)域(region of differences,RD)基因是BCG菌株完整的缺失片段，這些基因近年來在結(jié)核病的免疫學(xué)診斷上具有重要的研究價值而備受關(guān)注[6]。以研究較為成熟的RD2為例，臨床上已開始使用Rv3874編碼的CEP10，Rv3875編碼的ESAT-6多肽作為IGRA的刺激抗原[7]。本研究對結(jié)核分枝桿菌RD15基因Rv1976c進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，根據(jù)全血IFN-γ分析試驗(yàn)(whole blood IFN-γ release assay，WBIA)結(jié)果來評價抗原Rv1976c在結(jié)核病輔助診斷中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株(山西長治醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科)；E.coliDH5α、BL21(DE3)菌株(TianGen生物公司)；質(zhì)粒pPROEX(Novagen公司)。

1.1.2 主要試劑

抗His鼠單抗(TianGen生物公司)；BamH Ⅰ，Hind Ⅲ，T4工具酶，質(zhì)粒提取試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒(上海生工生物公司)；SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒(BBI 生命科學(xué)有限公司)；Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)(德國QIAGEN公司)；人外周血IFN-γ ELISA檢測試劑盒(深圳達(dá)科為公司)；內(nèi)毒素去除試劑盒(南京金斯瑞公司)；rEC(融合蛋白ESAT6-CEP10，自制)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

分析pPROEX質(zhì)粒、Rv1976c全序列相關(guān)對應(yīng)的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，上游P1.TTCGGATCCCGGTGGATTGTCGACGGTATGAACG，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)；下游P2.ATAAGCTTCTGCGTGCGGCGGGCCGCC，下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件：94.0 ℃，5 min；94.0 ℃，40 s；65.0 ℃，40 s；72.0 ℃，30 s，30個循環(huán)；72.0 ℃，10 min；得到擴(kuò)增片段大小為408 bp。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過細(xì)菌基因組提取試劑盒提取出結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株DNA作為模板，以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ將PCR產(chǎn)物Rv1976與N端標(biāo)記有6-His的pPROEX載體雙酶切后純化，再以T4連接酶過夜連接；使用Ca2+熱休克法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E.coliDH5α菌株中過夜培養(yǎng)，得到重組質(zhì)粒pPROX-Rv1976c，再以BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3 底物蛋白rRv1976c表達(dá)和純化

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1976c通過Ca2+熱休克法轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)菌株，過夜培養(yǎng)后以終濃度為0.5 mmol/L，體積為3 μL的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，使用Ni-NTA蛋白系統(tǒng)進(jìn)行純化，再利用內(nèi)毒素清除試劑盒清除內(nèi)毒素(<0.1 EU/mL)，利用12%SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡法(鼠抗His單抗作為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠作為二抗)鑒定蛋白。

1.2.4 WBIA檢測不同人群外周血抗原特異性IFN-γ水平

(1)研究對象分組

從山西省長治醫(yī)學(xué)院和平醫(yī)院募集符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的32名受試者(排除合并免疫性疾病及HIV感染)進(jìn)行問卷調(diào)查及全身體檢，為了避免卡介苗接種的影響，根據(jù)rEC-WBIA檢測結(jié)果，并聯(lián)合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分活動性肺結(jié)核患者(ATBs組)、潛伏感染者(LTBIs組)和健康對照者(HCs組)，見表1。

表1 研究對象分組及臨床特征Table 1 Subject grouping and clinical characteristic

(2)WBIA試驗(yàn)

無菌采集受試者肝素化全血5 mL，6 h內(nèi)加入無菌24孔板，每孔0.5 mL并以5 μg/孔 rRv1976c蛋白進(jìn)行刺激，置37 ℃溫箱孵育20 h(另設(shè)PHA和PBS為陽、陰性對照組)。刺激結(jié)束后，分離并收集上清液于滅菌EP管，使用人預(yù)包被IFN-γ ELISA試劑盒檢測各孔IFN-γ濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔OD值及濃度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各孔IFN-γ的含量，各受檢者以rRv1976c蛋白刺激后血清中IFN-γ的含量減去PBS刺激后血清中IFN-γ的含量即為rRv1976c蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IFN-γ含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，WBIA檢測不同人群IFN-γ水平采用非參數(shù)U檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pPROEX-Rv1976c構(gòu)建和鑒定

PCR擴(kuò)增的Rv1976c堿基大小為408 bp，插入pPROEX(+)構(gòu)建出重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1976c，經(jīng)過BamH Ⅰ，Hind Ⅲ雙酶切鑒定質(zhì)粒構(gòu)建正確，見圖1。

(a) 重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1976c構(gòu)建模式圖；(b) pPROEX-Rv1976c酶切鑒定圖1 重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1976c構(gòu)建和酶切鑒定Fig.1 Recombinant plasmid pPOEX-Rv1976c was constructed and identified by enzyme digestion

2.2 rRv1976c表達(dá)、純化和蛋白質(zhì)印跡分析

以Ca2+熱休克法將重組質(zhì)粒pPROEX-Rv1976c轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，表達(dá)的rRv1976c蛋白經(jīng)Ni-NAT柱純化后進(jìn)行SDS-PAGE檢測后，目的蛋白分子量大小為15.96 kD，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖2(a)。再經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)其表達(dá)成功，見圖2(b)。

圖2 rRv1976蛋白表達(dá)、純化和免疫印跡分析鑒定Fig.2 rRv1976 protein expression，purification and Western blotting analysis

2.3 rRv1976c誘導(dǎo)ATBs、LTBIs和HCs特異性IFN-γ水平比較

PHA誘導(dǎo)的ATBs和LTBIs，ATBs和HCs，LTBIs和HCs外周血中產(chǎn)生的IFN-γ水平之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=0.124，0.100，0.082，均P>0.05),見圖3(a)；rRv1976c刺激ATBs外周血T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于LTBIs，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=3.783，P<0.05)，rRv1976c刺激ATBs外周血T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于HCs，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=3.907，P<0.05)，rRv1976c刺激LTBIs外周血T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平顯著高于HCs，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(u=3.674，P<0.05)，見圖3(b)。

(a) rRv1976c刺激ATBs，LTBIs，HCs產(chǎn)生IFN-γ水平；(b) PHA刺激ATBs，LTBIs，HCs產(chǎn)生IFN-γ水平圖3 PHA和rRv1976c誘導(dǎo)不同人群全血IFN-γ水平比較Fig.3 Comparison of whole blood IFN-γ levels induced by PHA and rRv1976c in different groups

3 討論

隨著結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)和細(xì)胞分子水平研究的深入以及結(jié)核病致病機(jī)制的逐步明確，CD4+Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答被公認(rèn)為與結(jié)核分枝桿菌感染密切相關(guān)。國內(nèi)外研究[8-11]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染者CD4+T細(xì)胞受刺激所釋放的Th1型細(xì)胞因子(尤其是IFN-γ)是結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體的一項(xiàng)重要免疫標(biāo)志，由此IGRA逐漸成為近些年輔助診斷結(jié)核病的新型免疫學(xué)方法。

目前臨床上主要通過T-SPOT和ELISA兩種IGRA方法來輔助診斷結(jié)核分枝桿菌感染者，且兩種方法均采用來自結(jié)核分枝桿菌的特異性刺激性抗原(CFP-10和ESAT-6)?，F(xiàn)在證實(shí)IGRA比TST更具備特異性，且不受BCG的干擾[8-9]，可有效提高結(jié)核分枝桿菌感染者的檢出率。然而，IGRA亦有缺陷，主要體現(xiàn)在檢測方法、檢測對象上存在差異性。首先有研究[10]發(fā)現(xiàn)在年齡超過60歲的老年結(jié)核病患者檢測中，T-SPOT的敏感性較ELISA明顯降低。此外，使用T-SPOT在馬來西亞人群結(jié)核病檢測敏感度上也較中國患者顯著降低[11]。其次，即使檢測特異性針對的是結(jié)核分枝桿菌的和接種過的BCG菌株，由于存在某些非結(jié)核分枝桿菌菌株引起的交叉反應(yīng)，使得檢測特異性降低[12]。再則，在免疫系統(tǒng)受損的受試者中以及5歲以下的兒童也可能會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[13-14]。由此可見，搜索并測試結(jié)核分枝桿菌感染者特異性強(qiáng)、敏感度高的免疫標(biāo)志物，從而用于結(jié)核病的有效診斷和預(yù)防，勢在必行。

由于20世紀(jì)60年代凍干技術(shù)未被發(fā)明，BCG傳代培養(yǎng)中基因發(fā)生缺失，缺失的片段通稱為RD。RD基因序列從RD1到RD16包括了16個區(qū)域，一共129個開放閱讀框。研究[15-17]揭示許多RD潛伏期抗原可以在結(jié)核病的診斷中作為潛力靶抗原。有研究[15]成功表達(dá)出了結(jié)核分枝桿菌RD潛伏期抗原Rv1985c并利用其作為T-SPOT底物，在檢測活動性和潛伏性結(jié)核患者的靈敏度，分別達(dá)到71%和55%，在健康對照組中達(dá)到96.7%的特異性，這表明rRv1985c可能成為一種血清學(xué)診斷指標(biāo)。除此之外，RD的Rv3824，Rv3825，Rv1980c和Rv1984c編碼的分泌型抗原CEP10，ESAT-6，MPT64和CFP21同樣能夠引起機(jī)體強(qiáng)烈遲發(fā)型超敏反應(yīng)[7，16]，其中以CEP-10和ESAT-6底物蛋白的IGRA試劑盒已經(jīng)在臨床上使用[11]，而MPT64也已被廣泛應(yīng)用于血清抗體快速檢測試劑盒[17]。此次選擇構(gòu)建并表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌 RD15抗原rRv1976c，其誘導(dǎo)ATB患者和LTBI患者產(chǎn)生IFN-γ的水平均要顯著高于健康對照組，顯示出Rv1976c可被結(jié)核分枝桿菌感染者外周血T細(xì)胞所特異性識別，這顯示rRv1976可能是一種具有潛力的輔助診斷結(jié)核病的靶抗原。

值得一提的是，本研究誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌感染者外周血T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平偏低，而健康人群產(chǎn)生的IFN-γ更低，這可能是由同一個體不同的疾病感染階段對同一抗原的免疫應(yīng)答不同、個體差異性以及樣本量偏少所引起的。但是ATB患者、LTBI患者和健康人群產(chǎn)生的IFN-γ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明以絕大多數(shù)在BCG基因組中缺失結(jié)核分枝桿菌的RD抗原為基礎(chǔ)的血清學(xué)診斷具有獨(dú)特的優(yōu)越性，在之后的研究中若是能夠聯(lián)合應(yīng)用多種RD抗原或聯(lián)用佐劑可能會有效提高檢測的敏感性和特異性。