湯佳樂 徐海 苑平 何科佳 王仁才 卜范文

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，長沙 410125；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128；3. 國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中地區(qū)果樹科學(xué)觀測站，

長沙 410125）

由于全球變暖及不可避免的氣候變化，預(yù)計在不久的將來會使全球平均氣溫增加3-5℃［1］。隨著預(yù)測的氣溫上升，熱應(yīng)激成為了培育氣候適應(yīng)性作物的重要性狀。由于日氣溫和季節(jié)性氣溫的頻繁起伏而引起的長時間熱浪事件對世界范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，影響到植物的生長和產(chǎn)量，估計每年損失高達(dá)數(shù)十億美元［2］。因此，鑒于人口不斷增加，耕地和自然資源不斷減少，提高作物的耐熱性已成為一個緊迫的問題，而不僅僅是一個研究主題。

熱激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）是一種具有高度保守的蛋白質(zhì)家族，它廣泛分布于從原核生物到真核生物的各種生物體中［3］。在高溫脅迫條件下，熱激蛋白會在短時間大量表達(dá)積累，參與植物熱應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)，在維持植物細(xì)胞的穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報道，熱激蛋白具有伴侶活性［4］。這些熱激蛋白也被稱為分子伴侶蛋白，在其他幾種輔伴侶蛋白的幫助下，它們與部分折疊或變性的蛋白質(zhì)結(jié)合，阻止其自我聚集或促進(jìn)它們以ATP依賴和獨立的方式正確折疊。這些熱激蛋白大致分為兩大類，即低分子量和大分子量的熱激蛋白，根據(jù)相應(yīng)蛋白質(zhì)的大小分為5大類：Hsp100/Clp、Hsp90、Hsp70、Hsp60/chaperonin和sHsps［5］。在正常情況下，它們具有許多細(xì)胞功能，如（1）新合成的蛋白質(zhì)折疊或協(xié)助折疊（Hsp70和Hsp60）；（2）引導(dǎo)蛋白跨細(xì)胞膜和細(xì)胞間室之間的轉(zhuǎn)運（Hsp70）；（3）阻止寡聚蛋白的聚集、分離和展開（Hsp70、Hsp100、Hsp90和sHsps）；（4）促進(jìn)不穩(wěn)定蛋白的降解（Hsp70和Hsp100）；（5）信號分子的形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活（Hsp70和Hsp90）［6］。

研究已證明，Hsp90s在控制細(xì)胞周期、細(xì)胞生存、激素和其他信號通路等多個細(xì)胞過程中起著至關(guān)重要的作用。Hsp90s在細(xì)胞蛋白中是組成性表達(dá)，但在非生物脅迫下（主要是高溫脅迫），其表達(dá)進(jìn)一步增加了幾倍［7-8］。在細(xì)胞對脅迫的反應(yīng)中扮演重要的角色，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。因此，在熱脅迫條件下開展植物Hsp90s的鑒定與分析和功能研究，對正確認(rèn)識熱應(yīng)激反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，熱脅迫基因的表達(dá)調(diào)控和提高植物的耐熱性具有重要的意義。本文從Hsp90s的結(jié)構(gòu)、Hsp90s與植物耐熱性兩個方面綜述近幾年Hsp90s分子機(jī)理的研究進(jìn)展，旨為推動植物熱激蛋白的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 Hsp90s的結(jié)構(gòu)

Hsp90s是分子量大小約為90 kD的熱激蛋白家族，它具有高度的保守性和穩(wěn)定性及分布廣泛的特點［9］。從不同植物中分離鑒定出的細(xì)胞器特異性Hsp90，酵母和動物的氨基酸同源性為63%-71%。在擬南芥中，4個AtHsp90位于細(xì)胞質(zhì)上（AtHsp90-1到AtHsp90-4），而AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7分別位于質(zhì)體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

Hsp90s主要是以同型二聚體存在，具有3個結(jié)構(gòu)域：高度保守的N端結(jié)構(gòu)域（NTD，～25 kD）、中間結(jié)構(gòu)域（MD，～40 kD）、C端結(jié)構(gòu)域（CTD，～12

kD）［10］。N端結(jié)構(gòu)域包含ATP結(jié)合位點，具有內(nèi)源的ATP酶活性，該位點是Hsp90內(nèi)源性ATP酶活性弱的原因。中間結(jié)構(gòu)域是底物蛋白結(jié)合的主要位點，通過一段高電荷連接區(qū)連接到N-末端結(jié)構(gòu)域。C端結(jié)構(gòu)域是二聚化的結(jié)合位點，也是鈣調(diào)蛋白和其他底物蛋白結(jié)合位點。在真核生物細(xì)胞中，Hsp90s的C端有一個保守的MEEVD結(jié)構(gòu)基序，該基序負(fù)責(zé)與含共伴侶的四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域（Tetratricopeptide repeat domain，TPR）相互作用。在真核生物中，細(xì)胞質(zhì)Hsp90存在兩種亞型，即誘導(dǎo)型α型和組成型β型，并且至少一種亞型在功能上對生物體生存至關(guān)重要［11］。由于其在不同的物種中相對分子質(zhì)量的差異，這些Hsp90s同源基因有著不同的名稱（如Hsp80、Hsp81、Hsp82、Hsp83、Hsp84和Hsp90等）。通 過分析Hsp90s基因的氨基酸序列可以揭示其亞細(xì)胞定位。這可能是由于在N端或C端區(qū)域存在可區(qū)分的氨基酸特殊基序，即細(xì)胞溶質(zhì)特異性Hsp90亞型的C端MEEVD基序和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性Hsp90亞型的C端HDEL基序，而葉綠體和線粒體特異性Hsp90亞型的N端信號肽序列特殊性延伸［12］。

2 Hsp90s與植物耐熱性

植物在高溫脅迫條件下，蛋白質(zhì)的折疊過程受到很大的影響，從而導(dǎo)致錯誤折疊蛋白的繁殖和蛋白質(zhì)功能障礙。為了緩解蛋白質(zhì)的錯誤折疊反應(yīng)，自然界開發(fā)了高效的植物分子伴侶機(jī)制，通過增加已有的分子伴侶水平和通過信號機(jī)制表達(dá)額外的伴侶來維持細(xì)胞內(nèi)的高質(zhì)量蛋白質(zhì)［13］。植物在熱激逆境條件下能夠誘導(dǎo)Hsps基因的表達(dá)，其中許多Hsps基因作為分子伴侶防止蛋白質(zhì)變性和維持體內(nèi)蛋白平衡，如果沒有這些分子伴侶的幫助，活細(xì)胞中的許多蛋白質(zhì)不能正常折疊［14］。然而，Hsp90s是一類在熱應(yīng)激條件下對維持細(xì)胞功能起重要作用的分子伴侶［15］。它們在植物的營養(yǎng)和生殖生長過程中起著重要的作用，調(diào)節(jié)著植物對各種生物和非生物脅迫的反應(yīng)。在熱脅迫條件下，Hsp90s在行使分子伴侶的功能、表達(dá)調(diào)節(jié)模式、生長發(fā)育過程及參與耐熱性方面發(fā)揮重要作用。

2.1 Hsp90s分子伴侶功能

當(dāng)植物體處在有害或極端的環(huán)境條件下，它們的細(xì)胞會激活并大量產(chǎn)生一類熱激蛋白，這類熱激蛋白也稱為分子伴侶蛋白。它們是蛋白質(zhì)穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，保護(hù)和保捍衛(wèi)細(xì)胞蛋白質(zhì)免受傷害。研究表明，Hsp90s是具有分子伴侶功能的一類蛋白質(zhì)家族［16］。Hsp90s作為分子伴侶與其他輔助蛋白協(xié)同工作，共同構(gòu)成了伴侶蛋白復(fù)合物的重要組成部分。它們和輔助蛋白與錯誤折疊的蛋白相結(jié)合，防止分子蛋白的聚集和后續(xù)的再折疊、協(xié)助新合成蛋白的正確折疊、維持蛋白質(zhì)功能穩(wěn)定及促進(jìn)異常蛋白的降解，在規(guī)避惡劣的生長環(huán)境條件下發(fā)揮著重要的作用。Song等［17］通過分析5個AtHsp90基因在酵母菌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞溶質(zhì)AtHsp90-1和AtHsp90-2具有與酵母相似的伴侶功能，在適宜和不適宜溫度下都能支持酵母突變體的生長。在熱脅迫條件下，細(xì)胞溶質(zhì)AtHsp90s能穩(wěn)定溫度敏感的Hsp90突變株的生物膜。該研究結(jié)果揭示了細(xì)胞溶質(zhì)AtHsp90s作為分子伴侶具有在熱應(yīng)激條件下穩(wěn)定植物細(xì)胞穩(wěn)定的功能。Kravats等［18］研究發(fā)現(xiàn)酵母中純化的Hsp90突變體蛋白在與Hsp70和輔伴侶蛋白（Hop）的協(xié)同作用下，在蛋白重塑方面存在缺陷。該研究證實，Hsp90與Hsp70和其他蛋白協(xié)同作用，在蛋白質(zhì)折疊中起關(guān)鍵性作用，使蛋白質(zhì)受體能自行折疊。Cha等［19］研究發(fā)現(xiàn)Hsp90與輔伴侶分子Dgp23與相互作用，通過抑制蘋果酸脫氫酶的熱聚集，在植物的耐熱性方面起重要作用。此外，Hsp90還能與其他蛋白協(xié)同作用，如Hip（Hsp70相互作用蛋白）和Hsp40等，它們在其他細(xì)胞重塑反應(yīng)中相互協(xié)作，在熱脅迫條件下蛋白的修復(fù)和細(xì)胞的存活均發(fā)揮積極的作用［20］。

2.2 熱脅迫條件下Hsp90s表達(dá)調(diào)節(jié)模式

高溫脅迫擾亂細(xì)胞的穩(wěn)定性，造成細(xì)胞正常代謝受阻，導(dǎo)致植物生長遲緩或者細(xì)胞死亡，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，如果發(fā)生在開花期間，則更容易受到傷害。高等植物無法適應(yīng)長期遭受超過45℃的高溫［21］。在高溫脅迫條件下，植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)失去生物活性可能歸因于蛋白質(zhì)聚集或蛋白質(zhì)錯誤折疊或兩者都有［22］。應(yīng)激誘導(dǎo)的聚集和錯誤折疊蛋白的積累過程是不可逆的，而且對細(xì)胞功能造成傷害。為了平衡熱脅迫下細(xì)胞中蛋白質(zhì)穩(wěn)定，植物細(xì)胞上調(diào)了幾個熱誘導(dǎo)基因，通常稱為“熱激基因”（Heat shock genes，HSGs），這些熱激基因的表達(dá)和積累，使植物在高溫下存活［23-24］。

植物在受到高溫脅迫時，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)不能維持正常的折疊結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生大量的解折疊結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。植物為了減輕解折疊結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的反應(yīng)，Hsp90s等熱激蛋白信號通路在細(xì)胞環(huán)境中被激活。在正常情況下，Hsp70（或Hsp90及多伴侶復(fù)合體）與熱激轉(zhuǎn)錄因子（Heat shock factor，Hsf）相互作用而使Hsf處于鈍化的單體狀態(tài)。Hsf是植物體內(nèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)熱激反應(yīng)的一類主要轉(zhuǎn)錄因子。在熱激反應(yīng)時，植物細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白（Hsps）與解折疊的蛋白相結(jié)合，使Hsf形成三聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與熱激元件（Heat-shock element，HSE）結(jié)合啟動Hsps基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生并積累Hsps。在熱激反應(yīng)減弱時，高濃度的Hsps能降低Hsf與細(xì)胞DNA結(jié)合的活性，促進(jìn)Hsf三聚體的解聚，于是Hsps又與Hsf相結(jié)合，使其恢復(fù)為鈍化的單體狀態(tài)，關(guān)閉Hsf的活性，抑制Hsps的過度合成（圖1）［25］。張海［26］對水稻中的9個Hsp90基因進(jìn)行了表達(dá)量分析，OsHsp90-2和OsHsp90-4在熱激脅迫的表達(dá)上調(diào)，并將它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌發(fā)現(xiàn)均能夠提高轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)胞活性和增強(qiáng)高溫逆境條件下的耐受力。因此，Hsp90s參與了植物的熱脅迫條件下的表達(dá)的調(diào)節(jié)，并通過產(chǎn)生和積累Hsps增強(qiáng)了植物的耐熱性，從何使植物細(xì)胞維持正常的生理行為。

2.3 Hsp90s與植物的生長發(fā)育

圖1 熱激條件下Hsp90s表達(dá)調(diào)節(jié)模式圖

目前，Hsp90s在植物生長發(fā)育方面的作用早已被公認(rèn)。在正常情況下，Hsp90s在細(xì)胞內(nèi)含量豐富，約占細(xì)胞總蛋白的 1%-2%，在細(xì)胞中呈高組成性表達(dá)［27］。在沒有脅迫的條件下，甘藍(lán)型油菜種子在發(fā)育和萌發(fā)過程中，Hsp90具有很高的表達(dá)量，表明了Hsp90在種子發(fā)育和萌發(fā)過程中起到了重要的作用［28］。Sable等［29］對5個陸地棉基因型的微陣列數(shù)據(jù)分析顯示，在纖維發(fā)育的不同階段，GhHsp90基因的轉(zhuǎn)錄水平較高，進(jìn)一步的研究表明Hsp90在棉纖維的分化和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。Wang等［30］對小麥中細(xì)胞質(zhì)Hsp90基因進(jìn)行了系統(tǒng)測定，并通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）降低TaHsp90.1基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，對小麥幼苗生長有明顯的抑制作用，該研究證實了細(xì)胞質(zhì)Hsp90基因參與了幼苗的生長發(fā)育。此外，在熱激和其他應(yīng)激條件，Hsp90s可以進(jìn)一步誘導(dǎo)其表達(dá)。在正常條件下，經(jīng)抗生素處理的擬南芥種子在12日齡幼苗的時候可以激活Hsp90的合成［31］。AtHsp90-1是擬南芥中唯一可以被誘導(dǎo)的Hsp90成員，該基因在生長活躍期組成性表達(dá)水平較低，但在成熟的種子的胚胎中強(qiáng)烈地表達(dá)［32］。與組成型Hsp90突變體相比，AtHsp90-1系中不能存活種子和有缺陷胚的比例更大，且部分幼苗早死或生長發(fā)育遲緩［33］。這表明，可誘導(dǎo)的AtHsp90-1是植物穩(wěn)定生長和形態(tài)正常所必需的，尤其在胚的形成和種子成熟的時期。同樣，敲除AtHsp90-3的突變體導(dǎo)致擬南芥開花推遲［34］，敲除AtHsp90-5的突變體導(dǎo)致擬南芥的胚發(fā)育受損和種子活力喪失［35］，AtHsp90-7的缺失導(dǎo)致擬南芥的莖、花和根分生組織紊亂，花器官增多，花粉管加厚伸長［36］。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90還具有調(diào)控氣孔發(fā)育的功能。擬南芥Hsp90的相關(guān)突變體，通過熱激處理可以抑制氣孔的發(fā)育，并且Hsp90可以通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)正常和高溫條件下氣孔的起始和形成，調(diào)控氣孔的發(fā)育［37］。

Hsp90s也被認(rèn)為是形態(tài)學(xué)進(jìn)化的標(biāo)志［38］。這表明，Hsp90s具有管家蛋白的功能［39］。Neuwald等［40］研究發(fā)現(xiàn)Hsp90在熱脅迫下參與了植物的不同功能，如生物量的增加、結(jié)莢、減少脂質(zhì)過氧化和葉綠素的損失。Sangster等［41］對模式植物擬南芥Hsp90的抑制發(fā)現(xiàn)擬南芥表型結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，Hsp90的降低影響了開花時間和總結(jié)實率等生長發(fā)育過程中的多種數(shù)量性狀，增加了形態(tài)多樣性，降低了重復(fù)性狀的發(fā)育穩(wěn)定性?？傊?，我們認(rèn)為在許多不同刺激的環(huán)境條件下，Hsp90對植物生長發(fā)育反應(yīng)性具有全面性的影響。

2.4 Hsp90s參與植物耐熱性

不斷升高的溫度對地球生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，任何溫度的升高都會對植物的生長和產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響。在過去的10年里，組學(xué)研究顯示，在高溫脅迫條件下熱激蛋白受到了不同的調(diào)節(jié)。Song等［42］在ABA、PEG、NaCl、低溫和高溫脅迫條件下，對煙草Hsp90s的表達(dá)模式進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫對煙草Hsp90s的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。Agarwal等［43］通過對比耐熱和熱敏基因型鷹嘴豆的根、葉、花器官中的Hsp90基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)耐熱型鷹嘴豆的各個組織中Hsp90基因的表達(dá)量比熱敏型鷹嘴豆均有上調(diào)，并且在熱敏基因型鷹嘴豆中也能誘導(dǎo)Hsp90基因表達(dá)。這表明Hsp90s基因參與熱脅迫的響應(yīng)過程。同樣，許多模式植物和農(nóng)作物（擬南芥、煙草、水稻、大豆、葡萄、番茄和香蕉等）中，Hsp90s基因在熱脅迫條件的響應(yīng)已被鑒定，并已被證實參與調(diào)節(jié)耐熱性［44-45］。

此外，研究表明，Hsp90s的成員常被發(fā)現(xiàn)熱脅迫反應(yīng)中上調(diào)［46］。在高溫脅迫條件下，OsHsp90.1和AtHsp90的誘導(dǎo)量最大［47-48］。在大腸桿菌中，水稻OsHsp90-2過表達(dá)能夠提高細(xì)胞活力，顯著提高植株的在熱脅迫條件下的耐熱性［49］。同樣，12個大豆的GmHsp90基因在高溫脅迫下均能被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，其中5個GmHsp9基因的過表達(dá)增加了擬南芥對熱脅迫的耐受性［39］。Huang等［50］利用轉(zhuǎn)基因大豆中GmHsp90A2過表達(dá)的穩(wěn)定系和CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的突變系研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GmHsp90A2的T3轉(zhuǎn)基因大豆植株通過提高葉綠素含量和降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，表現(xiàn)出更高的耐熱性。相反，T2純合敲除GmHsp90A2突變體葉綠素含量降低，MDA含量增加，耐熱性下降，進(jìn)一步證明GmHsp90A2是正向調(diào)節(jié)植株的耐熱性。同樣，在擬南芥中敲除AtHsp90-1突變體使植株的耐熱性降低［51］。但是，也有證據(jù)表明，Hsp90的過表達(dá)可以降低植物細(xì)胞的耐熱性。在擬南芥中，AtHsp90.3的過表達(dá)降低了植物對熱脅迫的耐受性，表明Hsp90的穩(wěn)態(tài)性在植物的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和熱脅迫耐受性方面至關(guān)重要［52］。這可能是Hsp90的過量表達(dá)誘導(dǎo)Hsf的下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞的耐熱性降低的原因［53］；也可能是植物耐熱機(jī)理是受多個基因的協(xié)調(diào)調(diào)控，不是受到單個Hsp90基因的影響。Hsp90s基因與其他熱激蛋白基因家族協(xié)同作用，使植物細(xì)胞適應(yīng)高溫脅迫的作用，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

3 展望

高溫脅迫是影響植物生長發(fā)育，降低作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一。因此，提高作物的耐熱性等抗逆性已成為一個緊迫的問題。Hsp90s是參與植物熱應(yīng)激條件下應(yīng)答響應(yīng)的一類重要的基因家族。目前，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛使用，在理解植物耐熱性這一復(fù)雜性狀方面取得的一個重要進(jìn)展是越來越多的植物基因組序列信息的完成。但是對于不同植物基因組中的Hsp90s基因家族的鑒定、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體定位等尚需要進(jìn)一步深入研究和分析。因此，利用功能基因組學(xué)的方法，對植物Hsp90s基因家族進(jìn)行分析，并對其功能進(jìn)行精確的描述將成為新的重要研究方向。此外，大量可用的基因組數(shù)據(jù)的也使我們能夠識別參與熱脅迫應(yīng)答潛在的順式調(diào)控元件和反式因子。同時，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析植物Hsp90s基因在熱激條件下表達(dá)的差異，為進(jìn)一步闡明植物Hsp90s的誘導(dǎo)產(chǎn)生與積累的分子機(jī)制奠定了重要的研究基礎(chǔ)，并為Hsp90s基因功能分析和植物耐熱抗性品種的栽培選育提供廣闊的應(yīng)用前景。