伍婷婷 桂哲 秦迎秋 謝志雄

（武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072）

本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到一株革蘭氏陰性菌，通過(guò)生理生化檢測(cè)和全基因組測(cè)序分析，將該菌株命名為Pseudomonas donghuensisHYST［1］。研究發(fā)現(xiàn)東湖假單胞菌HYS菌株與常用于宿主感染研究的條件致病菌銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、PA14菌株相比，其能更顯著地縮短秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）的壽命，具更強(qiáng)的毒性，這表明東湖假單胞菌HYS中可能存在較為特殊的致病或毒性機(jī)制［1-3］。從構(gòu)建的東湖假單胞菌HYS轉(zhuǎn)座子插入突變庫(kù)中通過(guò)初篩復(fù)篩和基因定位后獲得一株可能是反σ因子基因位點(diǎn)插入突變株［4］。

假單胞菌中可選擇性的σ因子是最重要和常見(jiàn)的調(diào)控機(jī)制之一［5］。假單胞菌為響應(yīng)胞外的信號(hào)，含有可選擇性的σ因子σECF（胞外功能σ因子）的RNA聚合酶則可以起始轉(zhuǎn)錄特定基因。例如，毒性基因或毒性相關(guān)基因的表達(dá)，銅綠假單胞菌中大多數(shù)σECF介導(dǎo)的信號(hào)通路一般都會(huì)與跨膜蛋白反σ因子形成σECF/反σ因子系統(tǒng)，兩者共同調(diào)節(jié)σECF依賴(lài)型基因的表達(dá)［6-9］。

本研究從已獲得的轉(zhuǎn)座子突變株來(lái)探討東湖假單胞菌HYS中的SigW/RsiW（σ因子/反σ因子）參與其對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性及其可能的調(diào)控機(jī)制，旨為深入解析假單胞菌致病性調(diào)控機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 線(xiàn)蟲(chóng)、菌株、質(zhì)粒 秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)購(gòu)買(mǎi)于

CaenorhabditisGenetics Center（CGC）；Pseudomonas donghuensisHYS實(shí)驗(yàn)室保存；Escherichia coliS17-1實(shí)驗(yàn)室保存；Escherichia coliOP50（簡(jiǎn)稱(chēng)OP50）實(shí)驗(yàn)室保存。Saccharomyces cerevisiaePJ69-4A、S.cerevisiaePJ69-4α來(lái)源于高向東教授贈(zèng)予。質(zhì)粒pBBR1-MCS2（簡(jiǎn)稱(chēng)pBBR2）、pEX18Gm實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pGAD、pGBDU來(lái)源于高向東教授贈(zèng)予。

1.1.2 引物 本研究中所用引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，如表1所示。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基，NGM培養(yǎng)基［1］。YPD培養(yǎng)基，SC-Ura固體培養(yǎng)基，SC-Leu固體培養(yǎng)基，SC-Ura-Leu-His固體培養(yǎng)基，SC-Ura-Leu-His-Ade固體培養(yǎng)基，SC-Ura-Leu-His+3-AT固體培養(yǎng)基［10］。

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析工具 東湖假單胞菌HYS的核酸以及蛋白序列下載自NCBI網(wǎng)站（CP019396.1，WP_010226811.1，WP_010226809.1）。脫氧核苷酸及蛋白質(zhì)序列比對(duì)：NCBI網(wǎng)站。蛋白跨膜預(yù)測(cè)：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。

1.2.2 HYS基因組提取 采用BioMIGA細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，具體的操作方法參照試劑盒中革蘭氏陰性菌的說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 菌株對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的致死作用 配制NGM固體平板，向5個(gè)NGM固體平板分別滴加200 r/min振蕩過(guò)夜培養(yǎng)12 h的200 μL菌液，每個(gè)NGM固體菌苔放入20條秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)成蟲(chóng)，每種菌株共100條，每隔24 h計(jì)數(shù)平板中蟲(chóng)子的死活數(shù)量，直至全部死亡，其中以Escherichia coliOP50為陽(yáng)性對(duì)照，P. donghuensisHYS為陰性對(duì)照，利用SPSS 18.0軟件的Kaplan-Meier繪制線(xiàn)蟲(chóng)生存函數(shù)曲線(xiàn)，對(duì)于非正常死亡的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)記為“censored“，根據(jù)SPSS 18.0軟件得到的LT50具體數(shù)值由origin 9.0軟件繪制LT50點(diǎn)狀圖。

1.2.4 東湖假單胞菌HYS基因敲除方法 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增待敲除基因在基因組前后的各約500 bp左右的序列為上下游同源臂片段，分別與敲除載體pEX18Gm連 接，轉(zhuǎn) 化 至Escherichia coliS17-1。E.coliS17-1中的質(zhì)粒通過(guò)細(xì)菌接合導(dǎo)入東湖假單胞菌HYS，與HYS基因組發(fā)生同源重組，通過(guò)PCR檢測(cè)與基因測(cè)序最終確定目標(biāo)基因是否敲除。

1.2.5 酵母雙雜交 將要檢測(cè)相互作用的蛋白對(duì)應(yīng)的DNA片段擴(kuò)增，與含AD蛋白的質(zhì)粒pGAD或含BD蛋白的質(zhì)粒pGBDU分別連接，分別轉(zhuǎn)化至酵母菌pJ69-4A和pJ69-4α。將帶有不同質(zhì)粒的酵母菌pJ69-4A和pJ69-4α兩種菌株分別兩兩混合，選擇攜帶有兩種質(zhì)粒的二倍體細(xì)胞并分別影印到篩選平板上，恒溫培養(yǎng)并觀察是否有菌苔長(zhǎng)出，其中在平板SC-Ura-Leu-His生長(zhǎng)代表兩蛋白互作弱，在平板SCUra-Leu-His + 5 mmol/L 3-AT生長(zhǎng)代表兩蛋白互作中等強(qiáng)度，在平板SC-Ura-Leu-His-Ade生長(zhǎng)代表兩蛋白互作強(qiáng)。

1.2.6 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄PCR Trizol法提取RNA，用日本TaKaRa公司的試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）將已經(jīng)提取的總RNA中殘留的基因組去除并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。

1.2.7 熒光定量 采用日本TaKaRa公司的試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTMII），在儀器Bio-Rad熒光定

量PCR儀三步法PCR擴(kuò)增，最后用分析軟件Bio-Rad分析基因表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)中將野生型HYS菌株中目的基因的表達(dá)量始終設(shè)置為1，用參照基因rpoB作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 本研究中所用引物

2 結(jié)果

2.1 基因rsiW參與東湖假單胞菌HYS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性

編號(hào)為0201 7A的HYS插入突變株喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的LT50為4.739±0.190 d，比野生型HYS能夠延長(zhǎng)LT50約2 d（圖1）。轉(zhuǎn)座子在基因組上插入的位置及生信預(yù)測(cè)結(jié)果如表2和圖2所示，0201 7A中插入失活的基因?yàn)閞siW，編碼反σ因子。

表2 東湖假單胞菌HYS轉(zhuǎn)座子插入突變株

為確定rsiW是否參與HYS菌株毒性，構(gòu)建ΔrsiW敲除菌株及回補(bǔ)菌株并測(cè)定喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)后的生存函數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喂食ΔrsiW的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)LT50為5.053±0.143 d，與0201 7A突變株一致（圖3）。喂食菌株ΔrsiW（pBBR2-rsiW）的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)LT50為3.748±0.078 d，與喂食菌株HYS（pBBR2）的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)LT50基本一致，說(shuō)明ΔrsiW的缺失突變得到恢復(fù)，證實(shí)東湖假單胞菌HYS菌株中基因rsiW參與了其對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性（圖3）。

2.2 與反σ因子RsiW作用的σ因子確定

在HYS基因組中基因rsiW前面有一個(gè)注釋為RNA polymerase subunit sigma-24（σ24）的蛋白基因，RsiW為跨膜蛋白，氨基酸序列83-102是跨膜區(qū)域，1-82是膜內(nèi)N端，103-249是膜外C端（圖4），由經(jīng)典的σ因子/反σ因子系統(tǒng)特征初步推測(cè)σ24和RsiW是一對(duì)σ因子/反σ因子。

為確定σ24和RsiW是否是一對(duì)σ因子/反σ因子，分別將σ24以及RsiW的膜內(nèi)外片段構(gòu)建酵母雙雜交相關(guān)菌株，將構(gòu)建成功的任意兩種不同菌株混合影印到不同的固體培養(yǎng)基上。在SC-Ura-Leu-His、SCUra-Leu-His + 5 mmol/L 3-AT和SC-Ura-Leu-His-Ade培養(yǎng)基上的有菌苔生長(zhǎng)情況（圖5），顯示反σ因子RsiW與σ24存在蛋白互作，且RsiW通過(guò)RsiW-N與σ24互作，這說(shuō)明σ24是其對(duì)應(yīng)的SigW。

圖1 東湖假單胞菌HYS轉(zhuǎn)座子插入突變株喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生存函數(shù)（A）和半致死時(shí)間LT50（B）

圖2 0201 7A菌株基因插入位點(diǎn)蛋白比對(duì)

圖3 東湖假單胞菌ΔrsiW敲除菌株及回補(bǔ)菌株喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生存函數(shù)（A）和半致死時(shí)間LT50（B）

圖4 RsiW與RNA polymerase subunit sigma-24（σ24）跨膜預(yù)測(cè)

2.3 sigW參與東湖假單胞菌HYS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性

為確定SigW是否參與HYS菌株對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性，構(gòu)建其敲除菌株及回補(bǔ)菌株并測(cè)定喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)后的生存函數(shù)。喂食ΔsigW的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)LT50為3.728±0.103 d，但喂食ΔsigW（pBBR2-sigW）和HYS（pBBR2-sigW）的LT50分別為5.011±0.228 d和4.656±0.191 d，相對(duì)野生型HYS菌株延長(zhǎng)約2 d，具有減毒現(xiàn)象（圖6-A-B）。熒光定量PCR檢測(cè)減毒菌株ΔsigW（pBBR2-sigW）和HYS（pBBR2-sigW）中sigW的表達(dá)量顯著增加，增幅高于rsiW（圖6-C）。

與野生型HYS相比，喂食ΔsigW-rsiW的秀麗隱 桿 線(xiàn) 蟲(chóng)LT50為3.335±0.082 d，但 喂 食ΔsigWrsiW（pBBR2-sigW）的LT50為5.820±0.182 d，相對(duì)野生型HYS能夠延長(zhǎng)LT50約2 d，具有減毒現(xiàn)象（圖7-A-B）。熒光定量PCR減毒菌株ΔsigW-rsiW（pBBR2-sigW）中僅sigW高表達(dá)量（圖7-C）。以上結(jié)果說(shuō)明基因sigW參與東湖假單胞菌HYS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性，且存在一定的劑量效應(yīng)。

3 討論

本研究從轉(zhuǎn)座子插入突變庫(kù)中篩選出反σ因子RsiW參與東湖假單胞菌HYS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性，通過(guò)生物信息學(xué)分析，酵母雙雜交等實(shí)驗(yàn)鑒定出與RsiW發(fā)生蛋白互作的σ因子SigW，初步確定東湖假單胞菌HYS中存在SigW/RsiW（σ因子/反σ因子），且參與東湖假單胞菌HYS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性。假單胞菌毒性方面有關(guān)σ因子/反σ因子系統(tǒng)的研究顯示，在銅綠假單胞菌中主要發(fā)現(xiàn)AlgU/MucA（σ因子/反σ因子）與其致病性緊密相關(guān)［11］，而在枯草芽胞桿菌168中報(bào)道較詳細(xì)的是SigW/RsiW（σ因子/反σ因子）相互作用，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與毒性有相關(guān)性［11-15］，因此在假單胞菌中SigW/RsiW（σ因子/反σ因子）與毒性有關(guān)是一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)。

圖5 RsiW與SigW酵母雙雜交

圖6 東湖假單胞菌ΔsigW敲除菌株及回補(bǔ)菌株喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生存函數(shù)（A）、半致死時(shí)間LT50（B）及熒光定量結(jié)果（C）

圖7 東湖假單胞菌HYSΔsigW-rsiW敲除菌株及回補(bǔ)菌株喂食秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生存函數(shù)（A）、半致死時(shí)間LT50（B）及熒光定量結(jié)果（C）

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)假單胞菌反σ因子是單程跨膜蛋白，作為信號(hào)傳導(dǎo)的傳感器。C端胞外周質(zhì)域?yàn)閭鞲衅饔?，響?yīng)周質(zhì)或外膜中產(chǎn)生的信號(hào)；N端胞質(zhì)域?yàn)榉处医Y(jié)構(gòu)域（ASD），傳遞信號(hào)至對(duì)應(yīng)的σ因子處，約為80-90個(gè)氨基酸［7］。在枯草芽胞桿菌中，RsiW通過(guò)膜內(nèi)N端與對(duì)應(yīng)的SigW發(fā)生互作［16-17］。HYS菌株的酵母雙雜交結(jié)果顯示RsiW-C不能夠與SigW發(fā)生互作，而RsiW-N和RsiW能夠與SigW發(fā)生互作，推測(cè)HYS菌株RsiW的胞內(nèi)N端可能是將C端感應(yīng)的信號(hào)跨膜傳到SigW，參與胞外信號(hào)響應(yīng)從而參與毒性。

銅綠假單胞菌中σ因子/反σ因子系統(tǒng)若缺少誘導(dǎo)刺激，反σ因子對(duì)σ因子有抑制作用，核心RNA聚合酶不能與σ因子結(jié)合，導(dǎo)致下游相關(guān)基因不能表達(dá)，若過(guò)表達(dá)σ因子或者給相應(yīng)的誘導(dǎo)刺激，σ因子亦可調(diào)控σ因子依賴(lài)型基因的表達(dá)［17-20］。一般情況下若假單胞菌中毒性相關(guān)σ因子失活，σ因子不能調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而減少假單胞菌的毒性，但是也存在σ因子失活時(shí)，假單胞菌的毒性增強(qiáng)的情況［9，21］。本研究結(jié)果顯示，ΔsigW和ΔsigW-rsiW喂 食 秀 麗 隱 桿 線(xiàn) 蟲(chóng) 的LT50時(shí)間與野生型HYS菌株的基本一致，而sigW表達(dá)相對(duì)rsiW較強(qiáng)時(shí)可存在減毒效應(yīng)，這說(shuō)明SigW通過(guò)RsiW互作參與東湖假單胞菌HYS對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)毒性作用且存在一定的劑量效應(yīng)，即在東湖假單胞菌HYS菌株中SigW沒(méi)有被RsiW抑制時(shí)，SigW依賴(lài)型基因表現(xiàn)出對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的減毒效應(yīng)，但具體是哪些途徑基因表達(dá)受SigW影響及調(diào)控機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入探討。

東湖假單胞菌HYS對(duì)模式生物秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)具有強(qiáng)烈的毒性，作為潛在的生物致病菌株，其毒性機(jī)理目前尚不明確，本研究的可選擇的σ因子SigW為探討東湖假單胞菌HYS菌株中毒力因子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為未來(lái)東湖假單胞菌HYS可能引起的動(dòng)物感染治療提供思路。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)東湖假單胞菌HYS存在SigW/RsiW（σ因子/反σ因子），該系統(tǒng)參與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的毒性，且存在一定的劑量效應(yīng)，該發(fā)現(xiàn)為深入理解假單胞菌致病機(jī)制提供了新線(xiàn)索。