張林義 宋晨 徐瑤瑤 王嘉寧 王進 岳正波 劉曉玲

（1. 合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院，合肥 230009；2. 中國環(huán)境科學研究院，北京 100012；3. 南京領先環(huán)保技術股份有限公司，南京 210029）

黑臭水體是我國目前突出的水環(huán)境問題［1-2］。黑臭成因復雜，現(xiàn)有研究認為可能是因為水體納入了超出自身凈化能力的有機污染物，這些污染物的降解嚴重消耗了水體中的溶解氧，致使水體呈現(xiàn)嚴重缺氧或厭氧狀態(tài)，這導致污染物進一步分解或轉化為致黑致臭的物質［3-4］。已有研究表明S2-離子是影響水體變黑的主要污染物［5-7］，它與水體中的重金屬離子結合生成的FeS、MnS、CuS等金屬硫化物累積并引起了水體變黑［7-8］。因此，將黑臭水體中的S2-離子氧化成為溶解態(tài)的SO42-離子是消除水體變黑的有效途徑［8］。

S2-離子轉化為SO42-的過程在天然水體中主要是由土著微生物完成［9］。然而，這種生物氧化過程在黑臭水體中由于S2-離子的累積及水體的嚴重缺氧而導致極其緩慢甚至受到阻斷［10-11］。硫氧化菌是一類可以將單質硫或還原性硫化物氧化為穩(wěn)定的SO42-離子的功能微生物［12-13］。目前，硫氧化菌已被用于處理有毒有害污染物、含硫危險廢氣、含重金屬污泥和銅礦溶出等方面［14-17］。近年來，微生物菌劑亦見于黑臭水體處理的報道［18-19］。如將戈登氏菌（Gordonia）、假單胞菌（Pseudomonas）與放線菌（Actinomyces）等單菌或菌群用于化學需氧量（Chemical oxygen demand，COD）、氨 氮（NH3-N）、總磷（Total phosphorus，TP）和重金屬離子等污染物的去除［20-22］。然而，這些微生物菌劑多以非硫氧化菌為主，較少涉及黑臭水體富含的關鍵污染物S2-的去除研究。

本研究從北京黑臭東沙河的泥水混合物中篩選分離出一株土著硫氧化菌。通過考察菌株的生長特性，對其對S2-離子的氧化特性，以及整個生物氧化過程中S2-賦存形態(tài)的變化，分析菌株的硫氧化能力。在此基礎上，結合高通量測序技術研究菌株的硫氧化功能基因，進一步探討菌株對S2-離子的主要生物氧化途徑，以期為黑臭水體的有效治理提供微生物菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生物樣品采集 本研究菌株來源于北京市的黑臭水體東沙河［7］，樣品采集方法參考前人文獻描述［23］。為保證菌源多樣性，采樣時進行多點布置，底泥與水樣分別采集。其中，水樣為河流表層水樣，采樣后通過10 μm濾膜過濾去除懸浮顆粒及藻類等雜質，并收集于無菌聚乙烯瓶中；底泥采用抓泥斗自水下0.5-1.0 m處采集，剔除石塊和動植物殘體等雜質后密封于無菌自封袋中。所有樣品在采集后均立即儲存在放置有冰袋的保溫箱中，確保樣品低溫、密封保存。在樣品采集結束后，將其立即帶回實驗室開展后續(xù)菌株的富集與分離實驗。采用底泥與水樣等比例均勻混合的方式獲取微生物富集分離培養(yǎng)樣本。

1.1.2 培養(yǎng)基及含S2-人工廢水 （1）富集培養(yǎng)基［24-25］：Na2S·9H2O 0.162 g/L，可溶性淀粉 2.00 g/L，KNO30.100 g/L，K2HPO40.050 g/L，NaCl 0.050 g/L，MgSO4·7H2O 0.050 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，營養(yǎng)瓊脂20.0 g/L。（2）分離純化培養(yǎng)基［24-25］：Na2S·9H2O 0.162 g/L，KNO30.100 g/L，K2HPO40.050 g/L，NaCl 0.050 g/L，MgSO4·7H2O 0.050 g/L，F(xiàn)eSO40.001 g/L，營養(yǎng)瓊脂 20.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸膏粉 5.00 g/L。（3）液體培養(yǎng)基［16］：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母浸膏粉 5.00 g/L。（4）含S2-人工廢水［26］：C6H12O62.50 g/L，K2HPO40.40 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，Na2S·9H2O 0.15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集與分離 將采集的東沙河微生物樣品充分混合均勻后，取5 mL按照1:100的比例稀釋于質量濃度為5%的無菌NaCl溶液中，將稀釋后的樣品接種于富集培養(yǎng)基上，在25℃恒溫的條件下培養(yǎng)2-3 d。當富集培養(yǎng)基上菌落生長較多時，用接種環(huán)挑取長勢較好的單菌落，在分離純化培養(yǎng)基上進行劃線，繼續(xù)在25℃恒溫條件下培養(yǎng)2-3 d。重復這一步驟對菌株進行分離純化，直至獲得所有菌落形態(tài)一致，且顯微鏡觀察各菌體細胞形態(tài)一致的平板，即為分離獲得具有硫氧化功能的單菌株。

1.2.2 單菌株種子液的制備 在無菌條件下，挑取純化后的單菌落，接種于含有100 mL滅菌后的液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在轉速120 r/min和恒溫25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，即獲得單菌株種子液。后續(xù)實驗取種子液按照5%（體積比）接種于無菌液體培養(yǎng)基中，在轉速120 r/min和恒溫25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d進行分批次培養(yǎng)，獲得實驗用菌體。

1.2.3 菌株的16S rRNA測序鑒定 取足量培養(yǎng)發(fā)酵后的菌液，將其在4℃和8 000 r/min條件下離心8 min，并用超純水清洗3次，獲得16S rRNA測序用菌體。樣品總DNA抽提采用生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255。實驗操作遵照試劑盒說明書。樣品PCR擴增以菌株總DNA為模板，擴增設計引物序列分別為27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT），擴增長度為1 500 bp。將擴增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將測序獲得的堿基序列結果通過美國國家生物信息中心（National center for biotechnology information，NCBI）中的Blast程序與數(shù)據(jù)庫GenBank中的核苷酸序列進行同源性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株的生長曲線及S2-氧化最適條件 將制備所得的單菌株實驗用菌體接入裝有200 mL含S2-人工廢水的錐形瓶中，在120 r/min的轉速條件下進行生物氧化反應48 h。通過改變唯一變量考察各生長條件對菌株生長量及菌株氧化S2-離子的影響。設計的變量分別為：溫度（5、15、20、25、30和35℃）；初始pH值（4、5、6、7和8）；初始葡萄糖濃度（0.01、0.10、1.00、2.50和5.00 g/L）以及初始菌濃度（0.01、0.10、0.50、1.00和2.50 g/L）。通過單因素實驗，確定溫度、初始pH值、初始葡萄糖濃度和初始菌濃度的最適條件。反應過程中細菌生長量通過OD600值表示。在最適條件下，重新接種擴培后的種子液于相同的實驗條件下考察菌株的生長曲線和S2-氧化曲線。

1.2.5 菌株對S2-離子的生物氧化途徑分析

1.2.5.1 菌株對S2-離子的生物氧化過程 菌株對S2-離子的生物氧化過程實驗在2組容積為5 L的生化反應裝置中進行。其中，一組為實驗組；另一組為對照組。每組反應裝置設置3組平行實驗。在反應裝置中，實驗組按照1 g/L的接種量將菌株接入含S2-人工廢水中，對照組不添加菌株，用以比較空氣中氧氣對S2-氧化的影響。硫氧化過程于最適條件下進行。在整個反應過程中定時取樣，測定水樣中S2-、S0、S2O32-、S4O62-、SO32-和SO42-的質量濃度。

1.2.5.2 菌株的基因組制備與測序 取足量培養(yǎng)發(fā)酵后的菌液，將其在4℃和8 000 r/min條件下離心8 min，并用超純水清洗3次，獲得基因組測序用菌體。采用的E.Z.N.A.? DNA Kit試劑盒（美國Omega公司）進行樣品總DNA的抽提；而PE文庫的構建利用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit試劑盒（美國Illumina公司）。橋式PCR的建立利用HiSeq PE Cluster Kit v4 cBot試劑盒（美國Illumina公司）。Illumina Hiseq測序過程委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.5.3 菌株的基因組組裝與注釋 測序獲得的Reads中包含Illumina Hiseq原始測序過程中產(chǎn)生的質量較低的Reads。因此，需要將測序之后獲得的Reads進行質量剪切以去除這些低質量Reads。將處理后的Reads使用IDBA-UD軟件拼接組裝優(yōu)化序列，統(tǒng)計長度不小于500 bp的contigs，獲得最優(yōu)組裝結果［27］。菌株的基因預測采用Glimmer 3.02軟件進行［28］，之后分別在Nr、Genes、String和Go等數(shù)據(jù)庫blastp比對所預測基因的蛋白序列，獲得預測基因的全部注釋信息。

1.2.6 分析測試方法 采用分光光度法測定S2-和S0的質量濃度。而，SO32-和SO42-的質量濃度采用離子色譜儀（CIC-D120，青島盛翰）測定。采用高效液相色譜法（LC-10AD，島津液相）測定S4O62-濃度。通過細菌計數(shù)法［29］測定菌株生長量，并以OD600值表示。

2 結果

2.1 菌株的篩選與鑒定

以硫化鈉作為唯一硫源從北京市黑臭水體東沙河的泥水混合微生物樣本中篩選高效硫氧化菌，通過分別開展富集培養(yǎng)和分離純化實驗獲得了一株對S2-離子具有高效氧化能力的硫氧化單菌株。菌株在分離純化培養(yǎng)基上進行25℃恒溫培養(yǎng)后，菌落為灰色半透明光滑圓形，邊緣整齊，質地光滑濕潤，直徑為2-4 mm，中央凸起。菌株在含S2-離子濃度為20.63 mg/L的培養(yǎng)基中對S2-的氧化率可達到57.0%。

將分離獲得的菌株進行16S rRNA測序鑒定，并將獲得的菌株序列通過NCBI中的Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知菌株的序列進行比對，結果顯示所獲得的菌株與多株Citrobacter菌屬已命名純培養(yǎng)菌株序列同源性高達99%以上。選取其中9條序列與篩選獲得的菌株序列通過Mega7軟件共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。因此，初步確定該菌株屬于檸檬酸桿菌屬，將其命名為Citrobactersp.sp1。

圖1 菌株sp1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株sp1的生長及硫氧化特性

2.2.1 溫度對菌株sp1生長及硫氧化率的影響 如圖2-A所示，在生物氧化反應48 h后，S2-離子的氧化率隨著溫度的升高顯著增加隨后則保持穩(wěn)定。在溫度較低時，菌株sp1對S2-離子的氧化率較低，在5℃時為10%；隨著溫度的升高，S2-氧化率呈顯著上升趨勢，并在30℃時達到最高值，即91.7%。然而，溫度對菌株sp1生長量的影響與S2-氧化率不同。隨著溫度的升高，菌株sp1的生長量逐漸升高并在30℃時達到最高值，即0.869，但當溫度繼續(xù)升高至35℃時，菌株sp1生長量反而出現(xiàn)明顯下降，為0.409。由此可見，菌株sp1對溫度的變化較為敏感。30℃的溫度最適合菌株sp1的生長及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.2 初始pH對菌株sp1生長及硫氧化率的影響 如圖2-B所示，在生物氧化反應48 h后，S2-離子的氧化率和菌株sp1的生長量均隨著初始pH的升高顯著增加隨后降低。在初始pH較低時，菌株sp1對S2-離子的氧化率和菌株sp1的生長量較低，在初始pH為4時分別為48.4%和0.123；隨著初始pH從強酸性改變?yōu)橹行?，S2-氧化率和菌株sp1生長量呈顯著上升趨勢，并在初始pH為7時分別達到最高值，即91.4%和0.823；隨著初始pH從中性改變?yōu)槿鯄A性，S2-氧化率和菌株sp1生長量反而出現(xiàn)下降，分別為83.1%和0.624。由此可見，菌株sp1對初始pH的變化較為敏感。當初始pH為7時，最適合菌株sp1的生長及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.3 初始葡萄糖濃度對菌株sp1生長及硫氧化率的影響 如圖2-C所示，在生物氧化反應48 h后，S2-離子的氧化率隨著初始葡萄糖濃度的升高顯著增加隨后保持穩(wěn)定。在初始葡萄糖濃度較低時，菌株對S2-氧化率較低，在初始葡萄糖濃度0.01 g/L時為4.5%；隨著初始葡萄糖濃度的升高，S2-氧化率呈顯著上升趨勢，并在初始葡萄糖濃度為1.00 g/L時達到最高值，為91.6%。初始葡萄糖濃度對菌株sp1的生長量及S2-氧化率的影響相似，隨著初始葡萄糖濃度的升高，菌株sp1的生長量逐漸升高，并在初始葡萄糖濃度為1.00 g/L時達到最高值，為0.846。但是，繼續(xù)增加初始葡萄糖濃度，菌株sp1的生長量及S2-氧化率均無明顯變化。因此，初始葡萄糖濃度為1.00 g/L時，最適合菌株sp1的生長及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.4 初始菌濃度對菌株sp1生長及硫氧化率的影響 如圖2-D所示，在生物氧化反應48 h后，S2-離

子的氧化率隨著初始菌濃度的升高顯著增加隨后保持穩(wěn)定。在初始菌濃度較低時，菌株sp1對S2-離子的氧化率較低，在初始菌濃度0.01 g/L時為5.2%；隨著初始菌濃度的升高S2-氧化率呈顯著上升趨勢，并在初始菌濃度為0.50 g/L時達到最高值，即91.7%。初始菌濃度對菌株sp1生長量的影響與S2-氧化率不同。隨著初始菌濃度的升高，菌株sp1的生長量逐漸升高并在初始菌濃度為1.00 g/L時達到最高值，為0.849。但是，當初始菌濃度繼續(xù)升高至2.50 g/L時，菌株sp1生長量反而出現(xiàn)明顯下降，為0.544。因此，綜合考慮菌株sp1的生長與硫氧化功能的發(fā)揮，初始菌濃度為1.00 g/L時，最適合菌株sp1的生長及發(fā)揮硫氧化的功能。

2.2.5 菌株sp1的生長曲線與S2-氧化曲線 將菌株sp1在最適條件下培養(yǎng)60 h，并定時測定細菌生長量和剩余S2-濃度，繪制菌株的生長曲線和S2-氧化曲線，結果如圖3所示。在接種菌株后的0-4 h，細菌生長量基本維持在較低水平，此階段為菌株生長的延滯期。從接種后的第4小時開始，細菌生長量開始顯著上升，并在第20 h達到一個最高值。因此，4-20 h為菌株生長的對數(shù)生長期。在菌株生長的延滯期和對數(shù)生長期，S2-的剩余濃度迅速下降，此時S2-氧化率達到90%以上。從第20小時開始，細菌生長量保持在一個穩(wěn)定狀態(tài)，但在第42小時開始迅速下降，可見菌株接種后的20-42 h為菌株生長的穩(wěn)定期；而，從42 h開始菌株進入衰亡期。在菌株生長的穩(wěn)定期，S2-剩余濃度仍緩慢下降，并在42 h達到最低值，為0.60 mg/L，此時S2-氧化率可達97.1%。之后，S2-的剩余濃度在菌株sp1的衰亡期保持基本穩(wěn)定的狀態(tài)。上述結果表明，菌株sp1對S2-的生物氧化過程主要發(fā)生在菌株接種后的0-20 h，即菌株生長的延滯期和對數(shù)生長期。

圖2 溫度、初始pH、初始葡萄糖濃度及初始菌濃度對菌株sp1生長及S2-氧化率的影響

圖3 菌株sp1的生長曲線和S2-氧化曲線

2.3 菌株sp1對S2-的生物氧化過程及硫氧化代謝途徑

2.3.1 菌株sp1對S2-的生物氧化過程 在S2-離子的生物氧化過程中，可能出現(xiàn)的無機硫離子主要包括6種：S2-、S0、SO32-、S2O32-、S4O62-和SO42-。將菌株sp1在最適條件下培養(yǎng)60 h并定時測定各賦存形態(tài)的硫離子的濃度變化，獲得在硫氧化過程中不同存在形態(tài)無機硫離子的變化曲線，結果如圖4所示。

圖4-A顯示在添加了Citrobactersp.sp1的實驗組中，S2-離子的氧化過程產(chǎn)生了S0、SO32-、S2O32-、和SO42-這5種無機硫的存在形態(tài)，且各種形態(tài)的無機硫離子濃度在整個生物氧化過程中均呈現(xiàn)明顯的變化趨勢。S2-離子濃度從0 h開始顯著下降，至18 h下降速率變緩，直至第 60 h達到最低值，為0.21 mg/L；而，在第60 h，S2-的氧化率達到99%。S0離子濃度在0-60 h中呈現(xiàn)波浪狀的變化趨勢，說明S0離子在整個氧化過程中存在動態(tài)的生成和消耗過程。SO32-離子濃度在生物氧化過程的第0.5 h存在一個峰值，為8.0 mg/L；之后，變化趨勢保持平緩。這說明在反應初期SO32-大量生成，隨后快速消耗；繼續(xù)延長氧化過程，SO32-的生成與消耗保持較為穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。S2O32-離子和S4O62-離子的濃度均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。其中，S4O62-離子濃度的最高值與達到最高值的時間均高于S2O32-離子。S4O6 2-離子濃度在反應的第30 h達到35.2 mg/L的最高值；S2O32-離子濃度在反應的第6 h達到7.89 mg/L的最高值。這表明S4O62-和S2O32-這兩種離子在反應前期，生成速率均要高于消耗速率。SO42-離子濃度在整個生物氧化過程中呈不斷上升趨勢，并在第60 h達到最大值，為14.97 mg/L。圖4-B顯示在未添加菌株sp1的對照組中，S2-離子濃度在整個氧化過程呈現(xiàn)較緩慢的下降趨勢；同時，其他形態(tài)的無機硫離子僅檢測到SO42-離子，且在反應60 h后濃度僅為0.23 mg/L。這說明空氣中的氧氣對硫離子的氧化作用并不明顯。

以上結果表明，相對于對照組，Citrobactersp.sp1的添加顯著促進了S2-離子向SO42-離子轉化的過程。這一過程伴隨著其他價態(tài)中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，是一個從非穩(wěn)定態(tài)逐步轉化到穩(wěn)定態(tài)的過程。在整個氧化過程中檢測到S0，SO32-，S2O32-和S4O62-這4種中間態(tài)離子的出現(xiàn)，它們的濃度都呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢，這說明Citrobactersp.sp1對S2-離子的氧化是一個復雜的生物過程，涉及到多種硫離子之間的相互轉化。

圖4 各存在形態(tài)無機硫的濃度變化

2.3.2 硫離子氧化功能基因及硫氧化代謝途徑 采用高通量測序技術對菌株Citrobactersp.sp1進行測序，并將基因組測序結果與現(xiàn)有文獻報道，公共數(shù)據(jù)庫NCBI中基因功能預測以及公共數(shù)據(jù)庫KEGG中有關硫氧化代謝途徑中相關基因的描述進行比較，獲得Citrobactersp.sp1菌株的硫氧化功能基因，如表1所示。從表1可見，菌株sp1中共檢測出44種與無機硫生物氧化過程相關的功能基因，這表明菌株Citrobactersp.sp1對S2-的代謝通路較為完整。

同時，菌株Citrobactersp.sp1具有將S2-氧化為SO42-的相關硫氧化功能基因。這些功能基因包括編碼硫醌氧化還原酶（Sulfide：quinone oxidoreductase，SQR）的hdrA基因，編碼黃素細胞色素c硫化氫脫氫酶（Flavocytochrome c，F(xiàn)CC）的fcc基因，編碼亞硫酸鹽還原酶（Sulfite reductase，SRN）的cysIJ基因，編碼異二硫化物還原酶（Hetero disulfide reductases，HDR）的hdrBC基因，編碼亞硫酸鹽氧化酶（Sulfite oxidase，SO）的sox基因簇，編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶（Phosphoadenosine phosphosulfate reductase，PAPS）的paps基因，編碼硫代硫酸鹽醌氧化還原酶（Thiosulfate quinone oxidoreductase，TQO）的soxVW基因，以及編碼連四硫酸鹽水解酶（Tetrathionate hydrolase，TTH）的tetH基因。因此，推斷菌株sp1同時具有PSO與S4I這兩條硫氧化代謝途徑，如圖5所示。

3 討論

硫氧化菌在自然界中廣泛存在，已有多個類群被分離和鑒定。本研究分離篩選得到的菌株具有檸檬酸桿菌菌落特征［30］，經(jīng)16S rRNA測序鑒定為檸檬酸桿菌屬，命名為Citrobactersp.sp1。近年來，對于檸檬酸桿菌屬微生物的代謝功能研究主要集中于降解三硝基苯酚、吸附重金屬及保護電極等方面［31-33］，對于硫氧化功能的研究鮮有報道。而菌株sp1有高效硫氧化能力，在含20.63 mg/L S2-離子的培養(yǎng)基中對S2-氧化率可達到57.0%。

菌株sp1對溫度及初始pH較為敏感，其最適溫度及初始pH分別為30℃和7；適當升高初始葡糖糖濃度及初始菌濃度可以使菌株sp1的硫氧化率和生長量顯著增加，但過高的初始菌濃度會導致菌株活性降低。這與前人的研究結果相似。Peter和Roger［34］研究亦發(fā)現(xiàn)，過高的微生物濃度可引起廢水的生物處理效率下降，甚至導致微生物活性的明顯降低。因此，菌株sp1的最適初始葡萄糖濃度及初始菌濃度分別為1.00 g/L和1.00 g/L。在最適條件下培養(yǎng)菌株sp1，可使S2-氧化率在第42 h達到最高值，為97.1%。其中，菌株sp1對S2-的生物氧化過程主要發(fā)生在菌株接種后的0-20 h，即菌株生長的延滯期和對數(shù)生長期，在第20 h時S2-氧化率已達到90%?，F(xiàn)有研究表明，國內(nèi)外學者分離得到的硫氧化菌對無機硫離子的氧化反應時間較長。如陳小紅［35］分離得到的硫氧化菌株需在接種后60 h達到最高氧化率。龐博文［36］分離得到的硫氧化菌株需在接種后52 h達到最高氧化率。Jaffer等［37］分離得到的硫氧化菌株需在接種后96 h達到最高氧化率。

表1 菌株sp1基因組中無機硫生物氧化過程相關基因

圖5 菌株sp1對S2-的生物氧化主要途徑

無機硫代謝途徑分析是近年硫氧化菌研究的熱點，它有助于認識和掌握菌株對無機硫離子的氧化機理［38］。不同種屬的菌株具有不同的硫氧化代謝途徑［39］；而同一種菌株亦可存在多條硫氧化代謝途徑［40］。因此，研究菌株的硫代謝途徑有助于識別菌株對不同無機硫離子的氧化能力，也為菌株硫氧化技術開發(fā)提供理論參考。前人研究表明，硫氧化菌氧化無機硫主要存在兩條代謝途徑，分別是副球菌硫氧化（Paracoccus sulfur oxidation，PSO）途徑和連四硫酸鹽介導的硫代硫酸鹽代謝（S4 intermediate，S4I）途徑［41］。PSO和S4I這兩條代謝途徑存在共同的硫氧化過程，包括從S2-離子向S0離子的轉化，從S2-離子和S0離子向SO32-離子的轉化和SO32-離子向SO42-離子的轉化。其中，S2-離子向S0離子的轉化主要涉及到的酶有硫醌氧化還原酶SQR和FCC［41］。S2-離子向SO32-離子的轉化主要涉及到的酶為SRN［42］；S0離子向SO32-離子的轉化主要涉及到的酶為HDR［43］。SO32-離子向SO42-離子的轉化存在直接氧化和間接氧化這兩種途徑，分別涉及到SO［44］和PAPS［45］。S4I途徑中還單獨存在經(jīng)由S2O32-離子到S4O62-再轉化為SO32-離子的代謝途徑，主要涉及到的酶有TQO和TTH［43，46-47］。

為了研究菌株Citrobactersp.sp1的S2-氧化途徑，對菌株sp1進行了生物氧化過程實驗及基因預測。從圖4可見，Citrobactersp.sp1的添加顯著促進了S2-離子向SO42-離子轉化的過程；在整個氧化過程中，S0，SO32-，S2O32-和S4O62-這4種中間態(tài)無機硫離子的濃度都呈現(xiàn)出明顯的變化趨勢。從表1可見，菌株sp1具有hdrA、fcc、cysIJ、hdrBC、sox簇、paps、soxVW和tetH基因。此外，測序結果雖未檢測出編碼SQR的sqr基因，但hdrA基因編碼SQR的作用已被證實［40］。因此，菌株Citrobactersp.sp1可能同時通過PSO與S4I這兩條代謝途徑將S2-氧化為SO42-。此外，PSO途徑中可能包含SO32-離子的直接氧化途徑與間接氧化途徑。代謝途徑中涉及到S0，SO32-，S2O32-，S4O62-這4種中間態(tài)無機硫離子。在PSO代謝途徑中，主要涉及到S2-，S0，SO32-，S2O32-和SO42-這5種無機硫離子。一部分S2-作為電子供體在SQR和FCC的共同作用下氧化為S0［41］，生成的S0繼續(xù)在grx基因的調(diào)控下被硫醇基團R-SH活化為硫烷硫原子R-S-SH，接著R-S-SH在HDR的作用下氧化為SO32-并重新生成R-SH［43］；而另一部分S2-則作為電子供體在SRN作用下直接氧化為SO32-離子［42］，中間產(chǎn)物SO32-通過直接氧化途徑和間接氧化途徑氧化為SO42-，其中，直接氧化途徑由SO調(diào)控［45］，間接氧化途徑由PAPS-APS調(diào)控［45］；此外，在此途徑中，S0與SO32-自發(fā)亦可反應生成S2O32-，而S2O32-在TST的作用下發(fā)生歧化反應重新釋放出S0和SO32-［46］。在S4I代謝途徑中，主要涉及到S2O32-，S4O62-和SO42-這3種無機硫離子。一部分S2O32-在TQO的作用下轉化為S4O62-［48-49］；接著S4O62-在TTH的作用下被氧化為SO42-［46-47］。

4 結論

本研究從北京市東沙河黑臭水體中篩選分離獲得一株能高效氧化S2-離子的菌株，經(jīng)鑒定，該菌株屬于檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），命名為Citrobactersp.sp1。在溫度25℃初始pH值7.0，初始葡萄糖濃度1.00 g/L，和初始菌濃度1.00 g/L的最適生長條件下，菌株sp1對S2-的氧化率最高可達97.1%。同時，在菌株對S2-的生物氧化過程中產(chǎn)生了S0、S2O32-、SO32-、S4O62-和SO42-這5種存在形態(tài)的無機硫離子。通過高通量測序技術推測菌株sp1具有完整的代謝通路，可能通過PSO途徑和S4I途徑將非穩(wěn)定態(tài)的S2-離子逐步轉化為穩(wěn)定態(tài)的SO42-離子。