宿強 左慧 晁躍輝 曾會明

（北京林業(yè)大學草業(yè)與草原學院，北京 100083）

結縷草（Zoysia japonica）為異源四倍體多年生禾本科植物，在我國遼東半島、膠東半島等地存在天然分布［1］，因匍匐莖可形成墊席廣泛用于綠地建造及坪床建植，是鄉(xiāng)土植物中重要的草坪地被。它具有耐高溫、抗干旱、耐鹽堿等較強的環(huán)境適應性［2］，但對真菌侵染的防御能力較弱，如夏季高溫高濕條件下常爆發(fā)草坪褐斑病嚴重損毀坪觀［3］，此類生物致病因子制約了其在國土綠化中推廣應用。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）系草坪褐斑病主要病原物，作為一種全球廣布的土傳性真菌，據(jù)統(tǒng)計可引起260余種人工栽種植物發(fā)病［4-5］，其中AG1 IA融合亞群尤易致使根及莖部腐爛［6］，引發(fā)水稻紋枯?。?］、馬鈴薯莖潰瘍?。?］等。關于R.solani對結縷草致病性的研究，殷萍萍［9］建立了侵染模型：根部接種12 h后少量菌絲出現(xiàn)并開始纏繞，24 h時菌絲體分支形成侵染墊吸附于根表面，至第36小時侵染結構發(fā)育成熟并侵入內(nèi)皮層細胞，在48 h完成侵染并沿莖部縱向擴展；但尚未就結縷草的免疫防御誘導機制進行探討。

當前草坪真菌病害管理仍依賴化學防治，而藥劑施用成本高且妨礙游憩服務功能，探索草種自身抗病能力的增強十分關鍵。水楊酸（Salicylic acid，SA）作為一種小分子酚類植物激素［10］，已普遍揭示其介導病程相關基因的轉錄調(diào)控，從而激發(fā)感病部位的防御反應及病原未觸及部位的系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquired resistance，SAR）［11-12］。大量植物中的驗證表明外施SA可有效抵御R. solani，如以0.2 mmol/L濃度處理馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖使菌核感染率降低73%［10］，對水稻（Oryza sativa）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）等禾本科植物施用亦會顯著降低菌體生物量［13］；故研究結縷草內(nèi)源SA合成途徑及R. solani脅迫下通路響應特征有助于抗病育種。植物SA合成路徑被歸納為苯丙氨酸途徑與異分支酸途徑兩類［14-15］，重要中間體分別為反式肉桂酸（trans-cinnamic acid，t-CA）［16］和異分支酸（Isochorismic acid，IC）［17］。然而現(xiàn)今對途徑選擇規(guī)律缺乏認知，結縷草中兩類途徑的活動特性也尚未受到關注。

本研究以結縷草基因組中控制兩類合成途徑的關鍵基因作為切入，依據(jù)R.solani根部侵染病程下的轉錄組高通量測序數(shù)據(jù)監(jiān)測表達模式，結合受侵染和未感染部位中SA水平與關鍵酶活性相關性對比，評估應對侵染時結縷草SA合成調(diào)控主導基因的表達效應，從而確定SA積累方式為抗病性分子育種設計提供路線。同時演示一種基于多組學數(shù)據(jù)鑒定特定脅迫條件下代謝通路選擇傾向的技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料

結縷草基因組采用ZJN r1.1版本［18］，Zhu等［19］提供經(jīng)檢驗合格的R.solani根部侵染去真菌轉錄組文庫（SRX1759268），其中T10代表未接種對照組，T11-T14分別代表于根部感染12、24、36及48 h 4個時間點。供試結縷草品種‘Zenith’購自Turf Merchants Inc.，侵染用AG1 IA型菌株由北京林業(yè)大學草坪研究所提供，SA激素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自LMAIBio Inc.。

1.2 方法

1.2.1 基因鑒定和Unigene匹配 以TAIR10.1注釋的SA合成控制基因［20］為索引，選取PLAZA數(shù)據(jù)庫中所在直系同源基因家族［21］集合作為查詢序列，以ZJN基因組中編碼基因作為目標序列，采用Reciprocal BLAST算法［22］挖掘結縷草內(nèi)同源基因（E-value < 1e-5）；再以同樣操作由入選基因查詢轉錄組Unigene從而匹配。通過InterProScan［23］和CDSearch［24］進行功能域檢測復核，基于MAST基序分析［25］比較基因結構標記特征序列位置，以MEGA最大簡約法［26］構建發(fā)育樹聚類。運用MCScanX［27］進行共線性分析以挖掘演化關系。對入選轉錄本以RPKM值［28］衡量豐度，其中Group 1僅使用T10 reads組裝，Group 2則取用T11-T14，兩種統(tǒng)計策略最大化去除真菌序列干擾并便于相互印證。表達量熱圖數(shù)值為生物學重復均值并以Complete方法聚合，色度階梯通過以2為底對RPKM取對數(shù)呈現(xiàn)。分析結果繪圖均借助TBtools［29］完成且應用默認參數(shù)。

1.2.2 侵染建立與樣品采集 使用MS培養(yǎng)基對消毒處理的結縷草種子萌發(fā)，在28℃恒溫、4 000 lx光照、晝夜16 h/8 h的培養(yǎng)箱中生長6周。取兩粒與R.solani菌株共同保存的無雜菌滅活種子作為媒介，置入結縷草植株根部接種并計時，其后于12、24、36及48 h采集發(fā)病根部及同株健康葉片為實驗組樣品；以0 h及以上時間點未接種植株相同部位作為空白對照。培養(yǎng)、接種與取樣均在無菌環(huán)境操作，樣品獲取后迅速置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 生化指標檢測及分析 SA濃度測定采用聯(lián)免疫吸附法。稱取50 mg組織樣品加入液氮充分研磨，添加1 mL PBS緩沖液（pH7.2）勻漿后依照試劑盒說明書操作并使用酶標儀在450 nm波長讀數(shù)。PAL活性檢測參考Lisker等［30］讀取290 nm吸光度，并定義酶活力單位（U）為每小時催化1 μmolt-CA轉換所需的酶量。所有樣品進行3次生物學重復，以相應時間點空白對照與0 h檢測值的差值對實驗組數(shù)據(jù)校正以消除正常生理波動干擾，測試結果使用PAST 3.0統(tǒng)計并檢驗差異性（P< 0.05）。

2 結果

2.1 基因識別及親緣分析

控制t-CA合成的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL，E.C. 4.3.1.5）基因家族序列源自67種植物，結縷草中存在9條直系同源基因；催化 IC生成的異分支酸合成酶（Isochorismate synthase，ICS，E.C. 5.4.99.6）基因序列獲取自49種植物，在結縷草中識別到4個序列高度相似的基因座。廣泛的參照有效克服物種親緣關系遠、目的序列保守程度低的障礙。查閱到的索引基因及關聯(lián)家族、結縷草基因座編號與簡寫名稱的對應關系列于表1?；蜃小皊c”后數(shù)字指示scaffold編號，“g”后數(shù)字為基因次序，可觀察到部分基因物理位置集中。

結縷草中眾多的PAL同源基因均通過了功能域復核，經(jīng)由結構分析以預測表達差異，構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹并繪制編碼蛋白特征序列與堿基區(qū)段分布圖以直觀展示（圖1）。MAST結果顯示ZjPAL1-ZjPAL5編碼蛋白特征序列坐落整齊，甚至對應mRNA外顯子間隔形式，UTR區(qū)域分布特征也高度趨同，推測具有更近的親緣關系。而ZjPAL6-ZjPAL9由于5'-UTR的丟失會導致轉錄起始受阻，此外ZjPAL7外顯子序列插入過多且編碼蛋白N末端贅余較長，ZjPAL9長度偏離于均值且讀取產(chǎn)物特征序列缺失嚴重，以上原因均預示ZjPAL6-ZjPAL9難以正常合成編碼蛋白。

對于結縷草中獲得的ICS極似序列，InterProScan判定顯示僅ZjICS1和ZjICS2的翻譯產(chǎn)物具備特征功能域，而在染色體位置上相接鄰的ZjICS3與ZjICS4則因不能承擔ICS蛋白功能被判定為偽基因。CD-Search分析進一步發(fā)現(xiàn)ZjICS2缺失大部分PLN02786超家族及近乎全部MenF超家族等重要結構域，與源自眾多植物的ICS序列比對顯示其分子進化發(fā)育相當不成熟?；趕caffold的共線性分析揭示sc00039與sc00018間存在大片段復制關聯(lián)，Z. japonica中ICS相似序列基因座因恰好位于其中隨之復制。而對ZjPAL1-ZjPAL5所處的scaffold分析發(fā)現(xiàn)，它們屬于相繼經(jīng)由染色體片斷重復及更復雜的染色體組加倍而演化出的等位基因（圖2），轉錄產(chǎn)物可以合并分析。

表1 結縷草中目標功能基因識別結果及命名

圖1 ZjPAL編碼蛋白特征序列及mRNA區(qū)段分布

圖2 ZjPAL1-ZjPAL5（紅線聯(lián)接）所在scaffold間的共線性分析

2.2 轉錄本匹配與豐度變化

Reciprocal Blast匹配結果出現(xiàn)6條與ZjPAL基因對應的Unigene轉錄本，依照RPKM計量的轉錄水平聚合為3類（圖3）：其中最富優(yōu)勢的轉錄本Ⅰ、Ⅱ與ZjPAL1-ZjPAL5類型相匹配，平行變化的RPKM值表明可以準確反映波動；代表ZjPAL6的轉錄本Ⅲ雖具有相似的豐度變化，但表達數(shù)量過低；而轉錄本Ⅳ、Ⅴ與Ⅵ的數(shù)值變動相對主流趨勢出入明顯，加上測序計數(shù)普遍不足因而參考性較低。以上轉錄水平觀測情況與通過基因結構分析預測的結果十分契合，兩種組裝策略生成的轉錄本Ⅰ和Ⅱ以極高的表達水平表明在R.solani脅迫下PAL基因中ZjPAL1-ZjPAL5聚類分支表達最為典型，而且在第36小時（T13）菌體侵染深入根內(nèi)皮層后轉錄豐度依然持續(xù)攀升，表現(xiàn)出對脅迫更加積極的響應。

圖3 ZjPAL轉錄本表達量變化

通過匹配還探測到兩條屬于ICS的Unigene且均屬于ZjICS1，與2.1判定結果一致，豐度平行變動再次反映了表達量觀測數(shù)據(jù)的可靠性（圖4）。RPKM值對比顯示ZjICS豐度從未超過ZjPAL1-ZjPAL5的10%，不過變化也有一定規(guī)律性：病程初期其轉錄活動不隨菌絲增殖而加強，且于24 h（T12）降至最低；在36 h（T13）表達水平隨感染程度加深呈現(xiàn)小幅升高后，卻又在侵染完成時回落至對照組的一半以下，對R.solani侵染總體消極應對。

圖4 ZjICS轉錄本表達量變化

2.3 SA濃度與PAL活性測定結果

從受感染根部和尚未染病葉片這兩類部位取樣測定的SA水平變化趨勢顯示（圖5-A），自接種起始至菌體吸附于根表面的24 h內(nèi)，根部和葉部中SA濃度同步上升且差量穩(wěn)定。但轉變發(fā)生于24-36 h間：與12 h和24 h兩個處理組相比，葉片中SA含量繼續(xù)顯著上升并于36 h達到最大值，但根部濃度卻不再顯著升高。隨即在36-48 h間，根部SA濃度出現(xiàn)劇烈下降，同時在48 h防御失敗，菌絲體完全占據(jù)根部；然而此刻葉片中SA含量的維持反映出為激發(fā)SAR效應需要保證信號分子充足供給，體現(xiàn)了SA對于結縷草植株啟動免疫反應十分重要。

對于關鍵基因表達量占據(jù)絕對優(yōu)勢的苯丙氨酸途徑，檢測于SA合成發(fā)揮關鍵調(diào)控功能的PAL酶活性（圖5-B），以評估基因產(chǎn)物的實際功效。結果顯示0 h根部初始PAL活性高于葉片近一倍，到12 h時兩者的倍數(shù)關系有小幅放大；隨后根部PAL活性顯著增強并于24 h達到極大值，但至36 h隨侵染深入降低了50%以上，由此SA濃度難以維持；最終在48 h酶活性降至最低，根部SA水平已發(fā)生顯著滑落。葉片中PAL活性與之比較，則相對保持穩(wěn)定且總體低于發(fā)病的根部，直到48 h因菌絲向上端擴展而顯著提升且首次高于根部，呈現(xiàn)有利于SA合成的調(diào)控態(tài)勢。以上分析表明PAL酶活性提升需求對病程進展緊密響應，其功能行使對于SA信號分子的積累起到主導作用，但實際效應會受到外來生物因子的干擾。

圖5 根部與葉片SA濃度及PAL酶活性變化

3 討論

各類植物中SA合成途徑的全面解析仍面臨諸多挑戰(zhàn)，對具體物種在特定生理條件下合成主導途徑的鑒定進展緩慢。目前擬南芥（Arabidopsis thaliana）中相關基因的功能效應鑒定最為深入，如此前僅在細菌中知曉異分支酸途徑中IC轉變?yōu)镾A的過程是由異分支酸裂解酶（Isochorismate pyruvate lyase）直接催化，直到最近于A. thaliana中首次鑒定出PBS3蛋白承擔對應功能［31-32］。研究顯示，病菌侵染或紫外線暴露下，A. thaliana植株內(nèi)90%以上的SA合成量經(jīng)由IC這一中間產(chǎn)物轉化而獲得，但兩種AtICS基因編碼酶具有截然不同的物理性質(zhì)和動力學參數(shù)［33］。AtICS1變異的sid2、eds16等易感突變體在發(fā)病時SA積累量僅相當于野生型的5%-10%，SAR激活能力也遭受損害［34］。UV輻射處理后，ics1突變體SA合成水平約為野生型的10%，對于ics1ics2雙突變體則進一步下降到4%［35］。這些證據(jù)表明A.thaliana體內(nèi)以苯丙氨酸為底物的另類途徑對SA積累亦有貢獻，但其程度相當小。類似地，原葉煙草（Nicotiana benthamiana）無論在生物抑或非生物脅迫下都主要經(jīng)由異分支酸途徑大量合成SA［17］；然而在受病原物侵染的大豆（Glycine max）中，兩種途徑對SA合成貢獻度幾乎等同［36］。綜上，建立一種快速鑒定代謝通路選擇傾向的方法對于相關生物農(nóng)藝性狀的改良很有幫助。

結縷草與A. thaliana的共性是均存在兩條ICS基因，而如上述及本研究所示，各自僅一條基因即AtICS1與ZjICS1在特定脅迫下具有相對于等位基因占優(yōu)的表達特點；但更大差異在于，結縷草在R. solani脅迫下由苯丙氨酸途徑充當SA合成主力。RPKM轉錄豐度計量法能夠消除基因長度和測序通量差異的影響使得表達水平可橫向比較，由于對應Unigene代表的ICS豐度較PAL豐度相去甚遠，即在數(shù)量上證明結縷草應對該菌侵染時偏好于采用苯丙氨酸途徑生成SA合成前體。比較兩類Unigene相對病程的變化情況，反映出兩種基因具有完全不同的響應模式：ZjPAL1-ZjPAL5在菌絲體吸附于根細胞之后始終上調(diào)表達且呈現(xiàn)加速，最終豐度至少達到啟動時（T11）的160%；與之反差的是，ZjICS1豐度在T12組即開始明顯下降，總體滑落趨勢隨時間推移愈加強烈，在36 h侵染深入后衰減已超過50%。綜上，此實驗條件下ZjPAL對病程響應的積極性遠勝于ZjICS；不過T13組ZjICS1表達量相對T12組的提升說明其亦有一定的響應能力。

在R.solani菌絲侵染結構成熟前，結縷草根中PAL活性增速領先于葉片，此后入侵部位的PAL即便加速轉錄上調(diào)以滿足SA合成需求，其表達的蛋白酶活性非但不同步上升反強烈減弱，此趨勢最終未能因基因轉錄積極響應而逆轉。這表明R.solani結構體穿入結縷草內(nèi)皮層細胞后會引發(fā)強烈的病理效應破壞SA合成以阻止下游防御反應啟動，具體生化機理有待解析。因此，克服單一途徑依賴的缺陷性在特定情景下對代謝補償十分必要，增強ICS響應能力并過量表達可作為結縷草在立枯絲核菌侵染下保障SA合成以激活防御的一種生物技術育種思路。

4 結論

選取同源基因數(shù)據(jù)庫PLAZA收錄的相關功能基因，應用Reciprocal BLAST從結縷草基因組中識別出可能控制SA合成的9條PAL及4條ICS序列，經(jīng)功能校檢與親緣分析劃分類型后，同從R. solani根部侵染轉錄組中篩選的Unigene匹配觀測表達模式。對比顯示ZjPAL1-ZjPAL5豐度遠高于ZjICS并且對病程響應更為積極，所調(diào)控的苯丙氨酸途徑是R.solani侵染下結縷草SA合成的主要途徑。生化分析顯示，菌體侵入內(nèi)皮層后根部PAL酶活性嚴重削弱致使SA含量難以維持并快速衰退，而葉片中由于酶活加強使SA保持高位水平。