陳富榮，王芳，吳永平，于洪波

（齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010080）

組胺為一種生物胺，存在于許多動(dòng)植物中，是生物體中的組氨酸在微生物脫羧酶的作用下脫羧而產(chǎn)生。少量的組胺不僅是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫損傷的重要介質(zhì)之一，而且對(duì)應(yīng)答和炎癥反應(yīng)也有著重要的調(diào)節(jié)作用。但過(guò)量的組胺會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜上的兩類(lèi)受體H1和H2作用而發(fā)生組胺中毒。魚(yú)粉作為優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白原料被廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)中，使用不新鮮、腐敗霉變的魚(yú)制作的魚(yú)粉很容易引起組胺含量過(guò)高，從而引起一系列組胺中毒事故。我國(guó)魚(yú)粉的國(guó)標(biāo)中對(duì)于一級(jí)品（紅魚(yú)粉）的組胺限量有規(guī)定要求（要求組胺≤500 mg/kg）[1]，世界衛(wèi)生組織（WHO）及聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）根據(jù)組胺50 mg的無(wú)可見(jiàn)有害作用水平（NOAEL）以及人類(lèi)每天魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品250 g的攝入量（根據(jù)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品的消費(fèi)數(shù)據(jù)以及專(zhuān)家的意見(jiàn)得出）得出組胺的限量為200 mg/kg[2]，但是對(duì)獸藥中的組胺限量目前沒(méi)有規(guī)定。目前，組胺的測(cè)定主要有分光光度法、熒光檢測(cè)法和液相色譜法[3]。藥物中組胺或者生物胺測(cè)定的方法還沒(méi)有報(bào)道，目前僅報(bào)道有食品中生物胺含量的測(cè)定[4]和動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定，均采用高效液相色譜法[5]。由于藥物中有機(jī)雜質(zhì)的干擾較多，普通光譜法容易受雜質(zhì)干擾，定量不準(zhǔn)確，因而本文在兩個(gè)國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了高效液相色譜法測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素藥物中的組胺。

1 材料與方法

1.1 材料

所用酒石酸泰樂(lè)菌素藥物為齊魯制藥（內(nèi)蒙古）有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑與儀器

組胺鹽酸鹽對(duì)照品，Sigma公司；乙腈，色譜級(jí)，天津市康科德科技有限公司；正己烷，色譜純，默克股份有限公司；三氯甲烷，色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；丙酮、氯化鈉、乙酸銨、氫氧化鈉，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙醚、36%鹽酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、甲酸，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；谷氨酸鈉，分析純，內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局；碳酸氫鈉，分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠(chǎng)；正丁醇，分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；丹磺酰氯購(gòu)自阿拉丁。

Waters e2695高效液相色譜儀（配2489紫外檢測(cè)器），美國(guó)waters公司；XS205型電子分析天平，梅特勒公司；LD1000-2型電子天平，龍騰科技有限公司；LD200-2型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；XW-80A渦旋振蕩器，上海精科事業(yè)有限公司；TGL-15B高速離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠(chǎng)；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)。

1.3 溶液配制

丹磺酰氯衍生劑溶液：稱(chēng)取約0.25 g丹磺酰氯于25 mL棕色容量瓶中，用丙酮溶解稀釋至刻度。

5%三氯乙酸溶液：稱(chēng)取約25 g三氯乙酸于250 mL燒杯中，用適量純化水完全溶解后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容至刻度。

含1%甲酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液：稱(chēng)取約0.77 g乙酸銨溶解于純化水中，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加入10 mL甲酸，用純化水定容至刻度。

流動(dòng)相A：量取100 mL含1%甲酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液加入900 mL乙腈。

由縣級(jí)水行政主管部門(mén)負(fù)責(zé)制定監(jiān)測(cè)預(yù)警各個(gè)工作崗位的責(zé)任制、汛期值班制度、設(shè)備設(shè)施運(yùn)行管理制度、設(shè)備設(shè)施維護(hù)制度、防汛物資的管理制度等，并統(tǒng)一制作，上墻明示。同時(shí)，各縣級(jí)水行政主管部門(mén)還要開(kāi)展定期、不定期的落實(shí)情況檢查制度，對(duì)情況不理想的地方要及時(shí)給予警告并落實(shí)整改措施。

流動(dòng)相B：量取900 mL含1%甲酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液加入100 mL乙腈。

組胺對(duì)照品貯備溶液：稱(chēng)取組胺鹽酸鹽對(duì)照品（純度＞99%）約33.4 mg，精密稱(chēng)定，于200 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，配成100 mg/L的組胺對(duì)照品貯備溶液。

對(duì)照品工作液：將上述組胺對(duì)照品貯備溶液稀釋至濃度為5.0 mg/L，臨用新制。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 試樣制備、提取和凈化

稱(chēng)取酒石酸泰樂(lè)菌素藥物約1.5 g，置20 mL離心管中，準(zhǔn)確加入15 mL提取液，振蕩提取，離心取上清液10 mL，轉(zhuǎn)移至試管中，加入氯化鈉，蝸旋振蕩使完全溶解，加入10 mL正己烷，繼續(xù)蝸旋振蕩，靜置分層后取下層試樣溶液，加入正己烷進(jìn)一步去除脂肪。

1.4.2 萃取

吸取5 mL上述除脂肪后的試樣溶液于離心管中，用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至12.0左右。加入5 mL正丁醇/三氯甲烷（1+1）混合溶液，渦旋振蕩并離心，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于棕色容量瓶中，將下層樣液再萃取，合并兩次的萃取液，用正丁醇/三氯甲烷（1+1）混合溶液稀釋至10 mL。另取5 mL萃取液加入200 μL鹽酸（1 mol/L）中，混合均勻，40 ℃下氮?dú)獯蹈桑尤?.5 mL鹽酸（0.1 mol/L）渦旋振蕩至殘留物完全溶解，待衍生。

1.4.3 衍生

1.4.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.5 方法學(xué)檢驗(yàn)

（1）定量檢出限：連續(xù)進(jìn)3針空白溶液，記錄在組胺峰的5倍半峰寬出峰時(shí)間范圍內(nèi)儀器的噪聲水平，并計(jì)算平均噪聲；連續(xù)進(jìn)6針0.001 6 μg/L濃度的定量限溶液，計(jì)算組胺峰的峰高與平均噪聲的比值。

（2）線(xiàn)性分析：分別制備系列濃度在0.001 6～7.497 0 mg/L的組胺對(duì)照品工作液，經(jīng)衍生化反應(yīng)后進(jìn)行高效液相色譜分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

（3）回收率：稱(chēng)取1.5 g酒石酸泰樂(lè)菌素藥物，經(jīng)提取、凈化后分別向其中加入0.47 μg/g、47 μg/g和56 μg/g的組胺對(duì)照品工作液，經(jīng)衍生化反應(yīng)后進(jìn)行高效液相色譜分析。

（4）精密度：在47 μg/g濃度下平行測(cè)定6個(gè)樣品，計(jì)算其RSD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜圖分析

在“1.4.4”試驗(yàn)條件下，得到組胺對(duì)照品、空白及空白加標(biāo)樣品色譜圖如圖1所示。由圖1可知，用本實(shí)驗(yàn)中的方法對(duì)酒石酸泰樂(lè)菌素藥物樣品中的組胺進(jìn)行提取、衍生化反應(yīng)后經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，色譜圖峰型較好，信號(hào)響應(yīng)高，且無(wú)干擾雜峰，說(shuō)明整個(gè)方法的提取和衍生化反應(yīng)效果較好。

圖1 試樣衍生化后色譜圖

2.2 方法學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 定量檢出限

圖2為0.001 6 μg/mL組胺對(duì)照品衍生化反應(yīng)后的色譜圖，經(jīng)計(jì)算信噪比大于10，6個(gè)對(duì)照品溶液的RSD為4.87%。由此可知，0.001 6 μg/mL作為方法的定量檢出限可以滿(mǎn)足酒石酸泰樂(lè)菌素藥物樣品中組胺的檢測(cè)需要。

圖2 組胺對(duì)照品衍生化反應(yīng)后色譜圖

2.2.2 線(xiàn)性范圍

如圖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：組胺衍生物在0.001 6～7.4970 mg/L濃度范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，回歸方程為Y=285 920.254 3X-22 171.568 7

圖3 組胺衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2.3 回收率

如表2所示，添加組胺濃度為0.47～56.00 μg/g范圍內(nèi)的3個(gè)加標(biāo)梯度下，平均回收率在101%～103%，滿(mǎn)足分析檢測(cè)要求。

表2 酒石酸泰樂(lè)菌素藥物樣品不同加標(biāo)濃度下的回收率

2.2.4 精密度

如表3所示，在47 μg/g濃度下平行測(cè)定6個(gè)樣品，其RSD值為0.708%，滿(mǎn)足分析檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

利用柱前衍生法和高效液相色譜儀測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素藥物中組胺的含量，該方法簡(jiǎn)便快速，基體干擾小，線(xiàn)性范圍寬，有較好的回收率和檢出限，適用于酒石酸泰樂(lè)菌素藥物中組胺的檢測(cè)。

表3 酒石酸泰樂(lè)菌素藥物樣品47 μg/g加標(biāo)濃度下的精密度實(shí)驗(yàn)