章琪，劉建平

（復(fù)旦大學生命科學學院，上海 200438）

G四聯(lián)體適配體獨特的結(jié)構(gòu)使其成為了理想的生物傳感器報告基團，其中膝溝藻毒素適配體（GO18-T-d）則是典型的G四聯(lián)體核酸分子，能夠特異性作用于膝溝藻毒素分子結(jié)合從而達到檢測目的[1]，但是其G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)易受到金屬陽離子的影響。由于G四聯(lián)體平面的4個鳥嘌呤羰基上都具有一個帶負電的氧原子，這4個氧原子排列于一個平面形成一個口袋，在金屬陽離子的誘導(dǎo)下，不同G四聯(lián)體平面通過π-π堆積形成一個穩(wěn)定的多平面結(jié)構(gòu)。因此，不同的金屬陽離子對G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響各不相同。本研究旨在探索適配體GO18-T-d的G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)在不同金屬陽離子如K+、Na+、Mg2+下的穩(wěn)定性強弱，評價不同金屬陽離子對其G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中所用的DNA、KCl、NaCl、MgCl2·6H2O由生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)，Tris購于國藥集團化學試劑有限公司，0.2 μm水相過濾膜購于上海安譜實驗科技股份有限公司。

G四聯(lián)體組成堿基由G四聯(lián)體打分軟件QGRS Mapper預(yù)測完成[2]，G四聯(lián)體拓撲結(jié)構(gòu)模型由核酸三維結(jié)構(gòu)可視化建模網(wǎng)站3D-Nus的G-Quadruplex模塊構(gòu)建[3]，適配體全原子結(jié)構(gòu)模型由結(jié)構(gòu)可視化軟件VMD構(gòu)建完成。分子動力學模擬Gromacs5.1.4軟件中進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 圓二色譜實驗

實驗中所用的緩沖體系為20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.5，共設(shè)計了3種不同離子的緩沖液，分別為10 mmol/L KCl、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2。制備2×buffer以供后續(xù)實驗所用。Nanodrop 2000測量核酸濃度后，利用buffer將核酸稀釋至10 μmol/L的濃度，將核酸樣品于95 ℃加熱10 min，再以2 ℃/min的速度降溫至室溫。圓二色光譜波長測量范圍為220～360 nm，檢測溫度25 ℃，掃描速度120 nm/min，重復(fù)掃描3次后取平均值。

1.2.2 分子動力學模擬

分子動力學模擬在Gromacs5.1.4軟件中進行，力場為AMBER99 bsc1力場[4]，采用SPC水模型建模；模型建立后，在體系中插入相應(yīng)離子以達到所需的離子濃度；恒溫和升溫過程由Gromacs5.1.4的模擬退火模塊完成。模擬體系搭建完成后，進行不同體系的核酸全長三維結(jié)構(gòu)模型的分子動力學模擬，模擬時間為20 ns。前10 ns體系溫度為293 K，隨后每個體系的模擬溫度從293 K升高到693 K。

2 結(jié)果與分析

2.1 GO18-T-d適配體G四聯(lián)體拓撲構(gòu)型的解析

圓二色譜實驗測得的適配體GO18-T-d圓二色譜圖如圖1所示。不同離子緩沖液下的適配體GO18-T-d均在270 nm處有一個正向吸收峰，而在240 nm處有一個負向吸收峰，而對照組（序列為5'-TCACGAACTTCATTAACTGACTTAC-3'，非G 四聯(lián)體序列）在250 nm處有一個負向吸收峰，在280 nm處有一個正向吸收峰。這一實驗結(jié)果說明對照組適配體為非G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，與其適配體序列相符，而適配體GO18-T-d在不同離子條件下均能形成平行式G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)；且不同離子條件下，適配體正峰峰值大小順序為K+＞Na+＞Mg2+，說明在K+的誘導(dǎo)下，適配體GO18-T-d形成G四聯(lián)體的比例高于Na+，Na+則高于Mg2+。

圖1 不同離子條件下適配體GO18-T-d圓二色譜特征吸收曲線圖

2.2 GO18-T-d適配體結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建

在確認適配體GO18-T-d的拓撲結(jié)構(gòu)后，利用G四聯(lián)體預(yù)測方法，成功獲取了該適配體的三位全原子結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同離子條件下適配體GO18-T-d三維結(jié)構(gòu)模型圖

2.3 不同離子條件下適配體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性評價

在獲得適配體GO18-T-d的3種不同離子條件下的三維全原子模型后，對其進行分子動力學模擬，結(jié)果如圖3所示。適配體在K+條件下，其G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)RMSD波動最小，組成G四聯(lián)體的Hoogsteen氫鍵數(shù)量維持在16個左右，熱穩(wěn)定性最高；Na+次之，Mg2+條件下，適配體G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性最低。這一結(jié)果同時也驗證了圓二色譜實驗中，K+下適配體GO18-T-d的正向吸收峰值高于Na+，Na+下適配體GO18-T-d的正向吸收峰值高于Mg2+的結(jié)果。

圖3 GO18-T-d適配體G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)RMSD及Hoogsteen數(shù)目變化統(tǒng)計圖

3 結(jié)論

K+在穩(wěn)定GO18-T-d適配體G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)方面的作用高于Na+和Mg2+，為構(gòu)建合理的適配體（GO18-T-d）緩沖體系提供了一定的理論支持，同時也提示了不同金屬離子對核酸G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的影響，為G四聯(lián)體生物傳感器的開發(fā)與檢測提供了一定的基礎(chǔ)。