佘伊莎，張甘良

（1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433；2.上海津曼特生物科技有限公司，上海201210）

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體的制備技術(shù)也越來越成熟。作為一種治療型生物藥品，單克隆抗體在醫(yī)藥市場上逐漸發(fā)揮出重要的作用，尤其在腫瘤及免疫系統(tǒng)疾病方面?？贵w的純化是抗體生產(chǎn)過程中重要的一部分，一般分為3步純化[1]，即親和層析加兩步離子交換層析，或親和層析加疏水層析及離子交換層析。

親和層析是單抗純化三步法中的第一步，是重要的純化步驟，主要起到捕獲蛋白的作用，即將抗體從細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中富集出來。經(jīng)過一步親和層析，細(xì)胞培養(yǎng)收獲液中的大部分雜質(zhì)都會(huì)從層析柱中流穿出去，抗體則會(huì)結(jié)合到層析填料上，在洗脫條件下抗體與填料分離，收集洗脫液，則可得到純度較高的抗體，再經(jīng)過之后的精純步驟進(jìn)一步提高樣品純度。

DOE（Design of Experiment，即實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)）是一個(gè)工具，一種實(shí)驗(yàn)方法，一種基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)[2]，可以用最少的實(shí)驗(yàn)確定關(guān)鍵性因素及其相互作用[3]。DOE的實(shí)驗(yàn)方法在生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中逐漸得到推廣，在原核細(xì)胞表達(dá)[4]、細(xì)胞因子[5]及抗體[6]等產(chǎn)品中使用該方法，通過對(duì)工藝更加全面的考察，達(dá)到降低工藝成本[7]、進(jìn)行工藝優(yōu)化[8]等目的。本研究使用DOE方法摸索親和層析的工藝條件，以最少的實(shí)驗(yàn)篩選出親和層析的關(guān)鍵工藝參數(shù)，并初步確定工藝參數(shù)范圍。

1 材料與方法

1.1 樣品

上樣樣品由上海津曼特生物科技有限公司經(jīng)細(xì)胞株開發(fā)后進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)，經(jīng)過一定培養(yǎng)天數(shù)后進(jìn)行收獲，收獲液經(jīng)深層過濾，得到澄清液，即為親和層析使用樣品。

1.2 儀器和試劑

AKTAAVANT150層析系統(tǒng)，美國GE公司；Vantage25層析柱，直徑1.1 cm，高25 cm，美國默克公司；MabSelectSure層析填料，美國GE公司。Tris，藥用級(jí)，美國ANGUS公司；稀鹽酸，藥用級(jí)，湖南爾康制藥股份有限公司；氯化鈉，藥用級(jí)，江蘇勤奮藥業(yè)有限公司；冰醋酸，藥用級(jí)，南京化學(xué)試劑；醋酸鈉，藥用級(jí)，南京化學(xué)試劑；1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

親和層析采用結(jié)合-洗脫模式進(jìn)行，澄清液中性條件上樣，低pH條件洗脫，收集洗脫液送檢測定質(zhì)量。平衡液為50 mmol/L Tris-HCl+0.15 mmol/L NaCl，pH 7.2，洗脫液為 50 mmol/L HAc-NaAc。如表1所示，采用三因素兩水平全因子分析DOE模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，輸入因子為柱高、載量、洗脫pH，輸出響應(yīng)值為回收率及洗脫液SEC（Size Exclusion Chromatography，分子排阻色譜法）單體純度。

表1 DOE實(shí)驗(yàn)條件

1.4 樣品分析

使用高效液相色譜法，用分子篩色譜分析檢測親和洗脫收集液的單體純度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用層析系統(tǒng)控制軟件自帶的數(shù)據(jù)處理功能模塊，將檢測數(shù)據(jù)逐一輸入對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件下，生成箱線圖及響應(yīng)曲面圖以進(jìn)行系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DOE實(shí)驗(yàn)的回收率及檢測的SEC-HPLC單體純度如表2所示。親和層析的目的是將抗體從細(xì)胞培養(yǎng)收獲澄清液中捕獲出來。由于澄清液一般成分較復(fù)雜，混有HCP（HostCellProtein，宿主細(xì)胞蛋白）、色素、培養(yǎng)基成分等，且上樣樣品體積較大，因此對(duì)于收率的要求為＞90%，SEC-HPLC單體純度的要求為＞95%。從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在柱高15～25 cm，載量 19～37 mg/mL 填料，洗脫 pH 3.2～4.0的范圍內(nèi)，SEC-HPLC純度無顯著差異，均在95%以上，滿足親和層析的要求。在洗脫pH為4.0的條件下，收率低于目標(biāo)值90%。

表2 DOE實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 輸入因子與輸出變量箱線圖分析

圖1為輸入因子與輸出變量箱線圖，對(duì)于回收率，洗脫pH具有顯著性影響，柱高、載量及洗脫pH之間沒有明顯的交互作用；對(duì)于SEC-HPLC單體純度，洗脫pH對(duì)其具有較大的影響，而柱高和載量對(duì)其的影響則較小。同時(shí)，柱高、載量及洗脫pH 3個(gè)因子之間的交互作用對(duì)SEC的純度影響也較小。

圖1 輸入因子與輸出變量箱線圖

2.2 回收率和SEC純度響應(yīng)曲面分析

從圖2中可以看出，對(duì)于回收率，以洗脫pH為X軸，與多條收率的等高線相交，驗(yàn)證了洗脫pH能顯著影響親和層析收率。若要滿足收率大于90%的要求，則洗脫pH應(yīng)控制在3.2～3.6。根據(jù)回收率等高線的趨勢，可以看出洗脫pH的值越低，載量越高，回收率就越高。

從圖3的SEC-HPLC的響應(yīng)曲面圖來看，洗脫pH為X軸，也與多條純度等高線相交，也同樣驗(yàn)證了箱線圖的結(jié)論。對(duì)于SEC純度，pH越高，載量越高，純度也越高。綜合考慮，3.2～3.6的洗脫pH范圍既能滿足收率＞90%，也能滿足SEC單體純度＞95%的要求，在不超載的情況下盡量使用高載量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，層析結(jié)果較好。

圖2 回收率響應(yīng)曲面圖

圖3 SEC純度響應(yīng)曲面圖

3 結(jié)論

洗脫pH為親和層析工藝中最重要的參數(shù)，初步確定了滿足工藝需求的操作值范圍為pH 3.2～3.6；柱高、載量及洗脫pH 3個(gè)參數(shù)間的交互作用對(duì)層析結(jié)果影響較??；洗脫pH和載量越高，產(chǎn)品SEC純度越高；pH越低、載量越高，則回收率越高。