朱海，荀順義，劉慶

（博瑞生物醫(yī)藥泰興市有限公司，江蘇泰興 225400）

目前，臨床上的抗真菌藥物主要包括唑類藥物、多烯類藥物、核苷類藥物等，卡泊芬凈是一種常見的脂肽類抗真菌藥物，其藥品制備期間，該藥物的前體肺念菌素Bo（PneumocandinBo）的發(fā)酵單位較低，導(dǎo)致有效成分獲得的批量少，影響經(jīng)濟效益，所以需要尋找一種更加有效的發(fā)酵工藝，爭取可進一步降低成本。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肺念菌素Bo由浙江海正藥業(yè)股份有限公司實驗室提供，批號HS707-3796。該物質(zhì)由微生物Glarealozoyensis發(fā)酵獲得并經(jīng)數(shù)步半合成修飾，獲得卡泊芬凈，因此在實驗期間，應(yīng)該結(jié)合該菌種的特性進一步分析[1]。

1.2 試劑與儀器

葡萄糖、可溶性淀粉，試劑級，國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；甘露醇，試劑級，河北華旭藥業(yè)有限公司；瓊脂，試劑級，BD公司；甘油，工業(yè)級，上海源景化學(xué)品有限公司；其他化學(xué)試劑均由市場采購。

E200顯微鏡，尼康公司；XC-280L冰箱，美菱；XP205電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司；FA2004分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；S1-2磁力攪拌機，上海司樂儀器有限公司；d-37520離心機，德國HETTICH公司。

1.3 初始培養(yǎng)基

1.3.1 平板培養(yǎng)基

成分為0.50%葡萄糖、1.00%的可溶性淀粉、1.50%甘露醇、1.50%酵母、0.08%硫酸鎂、2.00%瓊脂以及0.25%磷酸二氫鉀，設(shè)置滅菌溫度121 ℃，處理20 min。

1.3.2 種子培養(yǎng)基

成分2.00%葡萄糖、2.50%甘露醇、1.25%棉籽餅粉、0.80%黃豆餅粉、0.70%玉米漿干粉、1.10%的磷酸二氫鉀、1.00%硫酸錳以及0.56%硼酸，消毒溫度121 ℃，處理20 min。

1.4 實驗方法

初始控制參數(shù)為發(fā)酵溫度25 ℃，搖瓶裝量25 mL/250 mL，種植發(fā)酵移種量10%，培養(yǎng)周期（種齡）32 h，發(fā)酵培養(yǎng)周期12 d。

改變發(fā)酵溫度（23 ℃、25 ℃、27 ℃、29 ℃）、搖瓶裝量（15、20、25、30、35、40）、種齡（24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h）、移種量（4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%）進行單因素試驗，探究最佳發(fā)酵工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對肺念菌素Bo產(chǎn)量的影響

如圖1所示，在為期12 d的實驗中，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵基本是在72 h開始，此時27 ℃下的發(fā)酵效價最高，而23 ℃的最低，這是因為27 ℃適宜菌體快速生長，能夠快速進入次級代謝階段；隨著時間的推移，各溫度下的發(fā)酵產(chǎn)素能力均顯著提高；216 h時，25 ℃下的發(fā)酵效價超過其他3個溫度，并最終達到500 μg/mL左右。27 ℃下的快速生產(chǎn)優(yōu)勢在后期并沒有顯現(xiàn)，因為該溫度并非次級代謝的理想溫度。相比之下，25 ℃下雖然早期產(chǎn)素效價低于27 ℃，但是遠期產(chǎn)素效價更理想，符合肺念菌素Bo發(fā)酵要求。

2.2 搖瓶裝量對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

搖瓶裝量可以影響溶氧水平，進一步影響發(fā)酵啟動以及產(chǎn)素效價。如圖2所示，在15 mL、20 mL、25 mL的搖瓶裝量下，發(fā)酵結(jié)果無顯著變化，而當搖瓶裝量超過30 mL后，受溶氧減少等因素的影響，發(fā)酵效價顯著下降，證明此時的發(fā)酵已經(jīng)受到限制?？紤]到成本等因素的影響，選擇理想的搖瓶裝量為20 mL/250 mL。

圖1 溫度對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

圖2 搖瓶裝量對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

2.3 種齡對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

如圖3所示，40～48 h內(nèi)移種的效果最理想，此時移種的發(fā)酵效價普遍在530 μg/mL以上。菌絲濃度、種子液的pH值、粘度等參數(shù)變化會影響發(fā)酵啟動效果[2]，對不同種子培養(yǎng)周期的發(fā)酵效果進行跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的下降并無限接近最低點的情況下（pH值無回升情況），種子的質(zhì)量理想，此時種子菌體的進入，會消耗碳源等物質(zhì)并產(chǎn)生一系列酸性物質(zhì)，這是造成pH值下降的重要原因，隨著發(fā)酵的進行，pH值有明顯回升，這一結(jié)果說明實驗中的菌體已經(jīng)進入衰亡階段，不滿足移種要求；當菌絲濃度超過25%時，發(fā)酵效價指標理想。

2.4 移種量對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

如圖4所示，當移種量在10%～14%時，發(fā)酵效價整體處于較高水平，普遍＞580 μg/mL，最高達到610 μg/mL左右，為最優(yōu)值。造成這一結(jié)果的原因為：（1）從菌絲濃度變化情況來看，當移種量在15%以內(nèi)時，發(fā)酵菌絲濃度維持在40%左右，超過15%后，可發(fā)現(xiàn)菌絲濃度顯著下降，這表明隨著移種量的增加，肺念菌素Bo的發(fā)酵啟動，菌絲快速生長，營養(yǎng)物質(zhì)代謝速率增加，造成糖碳源消耗殆盡，影響了后期的肺念菌素Bo發(fā)酵。因此在生產(chǎn)環(huán)節(jié)，可將移種量控制在10%～15%。

圖3 種齡對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

移種量是指移入種子液體積以及發(fā)酵培養(yǎng)液體積之比，該比值決定了生產(chǎn)菌種的繁殖效率，一般使用較大的移種量，可進一步縮短細菌繁殖到達峰值的時間，加快產(chǎn)物合成期到來[3]。種子液中通常含有大量的體外水解酶，該物質(zhì)可方便基質(zhì)的利用，并加快菌體生長。同時，隨著種子量的增加，會使生長菌在短時間內(nèi)占據(jù)培養(yǎng)環(huán)境，成為環(huán)境內(nèi)的優(yōu)勢菌，不僅可避免其他菌種的繁殖，也能加快相同菌種的生長。但當移種量超過限值后，菌絲生長速度加快，培養(yǎng)液粘度有顯著增加，這一現(xiàn)象會提高衰老細胞所占比重，造成溶氧下降，不利于后續(xù)的發(fā)酵過程。同時，大量的接種還會產(chǎn)生更多的代謝廢物，成為阻礙代謝的因素。

圖4 移種量對肺念菌素Bo發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

肺念菌素Bo的發(fā)酵溫度應(yīng)控制在25 ℃，搖瓶裝量為20 mL/250 mL，移植種齡為40～48 h，移種量為10%～15%，該條件下進行發(fā)酵能夠取得理想的發(fā)酵效果，滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求。