汪宇煒,林柳月,胡詩婷,汪瀾,劉潔,2*
(1.湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院,湖北咸寧 437100;2.輻射化學(xué)與功能材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北咸寧 437100)
原花青素(Proanthocyanidins,PC)是一種常見的聚多酚類黃酮,廣泛存在于自然界的植物中,如葡萄籽中原花青素含量很豐富[1]。研究表明,葡萄籽原花青素具有良好的抗氧化功能,可以很好地清除自由基,醫(yī)治一些由自由基造成的疾病,還有抗毒消炎、防治心血管疾病等功效[2-3]。按聚合度差異可將原花青素分為3類:聚合度為1的單體,具體包括表兒茶素、沒食子酸、兒茶素等,聚合度在2~4的稱為低聚原花青素,聚合度在5以上的稱為高聚原花青素[4]。高聚原花青素的分子量比低聚體大,受到空間位阻的影響更大,其抗氧化能力往往低于低聚體[5]。因此,為了使原花青素的利用效益達(dá)到最大化,有必要對高聚原花青素進(jìn)行降解處理來提高其使用價(jià)值。
目前,降解高聚原花青素主要有化學(xué)降解法、生物降解法和物理降解法[6-8]。電子束輻照降解作為物理法的一種,具有方便、清潔且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。已有研究采用電子束輻照技術(shù)降解高分子聚合物和有機(jī)小分子,而利用電子束輻照降解高聚原花青素卻未見報(bào)道。本研究采用電子束輻照的方法來降解高聚原花青素,對經(jīng)過不同劑量電子束輻照后的高聚原花青素樣品,用香草醛鹽酸法測定其平均聚合度的變化,以期為電子束輻照原花青素的應(yīng)用提供參考。
98%葡萄籽高聚原花青素,西安艾諾醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司;香草醛、冰乙酸、鹽酸、無水乙醇、甲醇,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;(+)-兒茶素,分析純,sigma試劑公司。
7200可見分光光度計(jì),上海尤尼柯有限公司;UV-2300紫外可見分光光度計(jì),日本日立公司;AYU-120分析天平,日本島津公司;1 MeV電子加速器,美國沃氏公司。
1.3.1 高聚原花青素的提純
稱取一定量葡萄籽高聚原花青素,按照原花青素固體與乙醇1∶200(g∶mL)的固液比,用無水乙醇溶解原花青素固體,靜置12 h,過濾,濾液在45 ℃旋蒸去除乙醇,旋蒸后得到的固體置于45 ℃紅外干燥箱干燥,即為接下來實(shí)驗(yàn)要用到的高聚原花青素樣品。
1.3.2 電子束輻照處理
準(zhǔn)備6個(gè)密封袋,分別稱取0.2 g高聚原花青素樣品,置入密封袋中平鋪均勻,用膠帶封口固定,并送樣輻照。輻照總劑量設(shè)定為90 kGy、180 kGy、210 kGy、270 kGy、330 kGy和 390 kGy,劑量率為30 kGy/s。
1.3.3 香草醛鹽酸法測定高聚原花青素平均聚合度
1.3.3.1 測定波長的確定
取10 mL具塞比色管,依次加入1.0 mL原花青素甲醇溶液、5.0 mL香草醛甲醇溶液和1.5 mL鹽酸甲醇溶液,用無水甲醇定容至刻度,加塞振蕩使其混合均勻,避光反應(yīng)20 min后,立即于360~650 nm范圍掃描吸收光譜,據(jù)此選擇測定波長。另取10 mL具塞比色管,依次加入1.0 mL原花青素乙酸溶液、5.0 mL香草醛乙酸溶液和1.5 mL鹽酸乙酸溶液,用乙酸定容至刻度,加塞振蕩使其混合均勻,避光反應(yīng)5 min后,立即于360~650 nm范圍掃描吸收光譜,據(jù)此選擇測定波長。
1.3.3.2 顯色條件單因素實(shí)驗(yàn)
按照“1.3.3.1”配制顯色溶液,依次改變香草醛溶液和原花青素溶液體積比為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1,分別考察顯色溶液避光恒溫20 ℃、30 ℃和40 ℃情況下30 min內(nèi)吸光度的變化情況(每次實(shí)驗(yàn)測3次,結(jié)果取平均值,以下均同),確定香草醛溶液和原花青素溶液最佳體積比、最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。
1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
采用(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,在香草醛與標(biāo)準(zhǔn)品最佳反應(yīng)體積比以及最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間條件下,配制不同濃度的(+)-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)顯色系列溶液,測定每份溶液的吸光度值,分別繪制吸光度值與(+)-兒茶素甲醇溶液質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度值與(+)-兒茶素乙酸溶液物質(zhì)的量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.3.4 平均聚合度的測定
將輻照前后的原花青素樣品分別用甲醇和乙酸溶解,配制成一定濃度,在相同條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)并測定吸光度值,所得的吸光度數(shù)據(jù)代入對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到比色管中溶液的濃度,進(jìn)而換算出樣品溶液的濃度,再按照公式1計(jì)算原花青素的平均聚合度[9]。
式中,m為原花青素的質(zhì)量,μg;n為原花青素物質(zhì)的量,μmol;M為(+)-兒茶素的相對分子質(zhì)量(290 g/mol)。
圖1為原花青素-香草醛在甲醇體系和乙酸體系中的可見吸收光譜圖。由圖1可知,兩者均在500 nm處吸收最強(qiáng)。因此,測定高聚原花青素平均聚合度的實(shí)驗(yàn)中,均可選擇500 nm作為測定波長。
圖1 原花青素-香草醛體系可見吸收光譜圖
甲醇體系中,香草醛-原花青素體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1時(shí),顯色溶液在500 nm處的吸光度值隨時(shí)間變化如圖2所示。由圖2可知,加入的香草醛甲醇溶液與原花青素甲醇溶液體積比為4∶1時(shí),反應(yīng)在20 min基本完成且吸光度值最穩(wěn)定。因此實(shí)驗(yàn)選取香草醛甲醇溶液和原花青素甲醇溶液體積比為4∶1,反應(yīng)時(shí)間為20 min。
圖2 甲醇體系中不同香草醛-原花青素體積比時(shí)吸光度值隨時(shí)間變化
乙酸體系中,香草醛-原花青素體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1時(shí),顯色溶液在500 nm處的吸光度值隨時(shí)間變化如圖3所示。由圖3可知,加入的香草醛乙酸溶液與原花青素乙酸溶液體積比為3∶1時(shí),反應(yīng)在5 min基本完成。因此,實(shí)驗(yàn)選取香草醛乙酸溶液和原花青素乙酸溶液體積比為3∶1,反應(yīng)時(shí)間為5 min。
在上述條件下分別考察甲醇體系顯色溶液在20 ℃、30 ℃和40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min后吸光度值的變化,以及乙酸體系顯色溶液在20 ℃、30 ℃和40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min后吸光度值的變化,發(fā)現(xiàn)吸光度值均隨反應(yīng)溫度升高而降低(圖4)。因此均選擇20 ℃作為反應(yīng)溫度。
圖3 乙酸體系中不同香草醛-原花青素體積比時(shí)吸光度值隨時(shí)間變化
圖4 反應(yīng)溫度的影響
以(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,在甲醇體系中采用香草醛鹽酸法測定原花青素的質(zhì)量,得到吸光度與(+)-兒茶素質(zhì)量濃度(μg/mL)之間的線性方程為y=0.001 37x-0.022 6,R=0.998 1;在乙酸體系中采用香草醛鹽酸法測定原花青素物質(zhì)的量,得到吸光度與(+)-兒茶素物質(zhì)的量濃度(μmol/mL)之間的線性方程為y=32.244 7x-0.217 5,R=0.996 9。由圖5和圖6可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,且吸光度值基本處于朗伯-比爾定律最佳讀數(shù)范圍。
圖5 (+)-兒茶素質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖6 (+)-兒茶素物質(zhì)的量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線
經(jīng)不同劑量電子束輻照后的葡萄籽高聚原花青素樣品,在甲醇體系中采用香草醛鹽酸法顯色,測得吸光度值代入圖5標(biāo)準(zhǔn)曲線中,可得質(zhì)量濃度。在乙酸體系中采用香草醛鹽酸法顯色,測得吸光度值代入圖6標(biāo)準(zhǔn)曲線中,可得物質(zhì)的量濃度。結(jié)合兩者,乘以修正系數(shù),得到平均聚合度,具體如表1所示。由表1可知,電子束輻照總劑量從0 kGy升到180 kGy時(shí),高聚原花青素的平均聚合度由14.40降到14.12,只下降1.94%;當(dāng)輻照總劑量從180 kGy增加到270 kGy時(shí),高聚原花青素的平均聚合度從14.12降到12.48,下降11.61%;當(dāng)輻照總劑量從270 kGy升至330 kGy,高聚原花青素的平均聚合度從12.48降到9.08,下降27.24%;再增加輻照總劑量,從330 kGy到390 kGy,高聚原花青素的聚合度不僅沒有降低,反而增加到11.07,增加21.92%,這可能是由于降解后的小分子重新聚合引起[10]。電子束輻照過程中,產(chǎn)生的活性自由基使高聚原花青素?cái)噫?,平均聚合度降低,得到分子量較低的小分子。同時(shí),如果自由基反應(yīng)不能及時(shí)終止,得到的小分子有可能重新聚合。
不同溶劑條件下,香草醛鹽酸法的最適合反應(yīng)條件存在差異:以甲醇為溶劑,測定原花青素質(zhì)量濃度時(shí),香草醛甲醇溶液與原花青素甲醇溶液的體積比為4∶1,在20 ℃水浴中避光反應(yīng)20 min;以乙酸為溶劑,測定原花青素物質(zhì)的量濃度時(shí),香草醛乙酸溶液與原花青素乙酸溶液的體積比應(yīng)為3∶1,在20 ℃水浴中避光反應(yīng)5 min。電子束輻照總劑量在0~390 kGy時(shí),隨著劑量增加,高聚原花青素的平均聚合度先降低后升高,說明電子束輻照能夠降解高聚原花青素,但需要注意選擇合適的輻照劑量;另外,還需進(jìn)一步考察電子束輻照對高聚原花青素生物活性的影響。
表1 不同劑量電子束輻照后原花青素平均聚合度的變化