李賽男，呂怡娜，甘田，劉文華

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶 526061）

桿狀病毒是一類特異性感染節(jié)肢動(dòng)物的病原微生物，其典型特征是具有雙向復(fù)制周期，在復(fù)制周期中產(chǎn)生兩種不同形態(tài)和功能的病毒粒子，分別為芽生型病毒粒子（Budded virion，BV）和包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virion，ODV）。這兩種病毒粒子的囊膜結(jié)構(gòu)和組分不同，但是核酸相同以及核衣殼組成相近[1-3]。BV負(fù)責(zé)建立系統(tǒng)感染，ODV負(fù)責(zé)在昆蟲宿主中的水平傳播[3-8]。桿狀病毒在應(yīng)用上主要作為外源基因的高效表達(dá)載體和生物殺蟲劑[9]。

斜紋夜蛾（Spodoptera litura）俗稱夜盜蟲、黑頭蟲，又名蓮紋夜蛾，屬鱗翅目夜蛾科，是一種雜食性農(nóng)業(yè)害蟲，危害的植物達(dá)到109科389種，在亞洲、非洲、歐洲、大洋洲等地均有分布，經(jīng)常造成大范圍的嚴(yán)重災(zāi)害[10]。目前，斜紋夜蛾的防治方式主要有生物防治、誘殺成蟲和化學(xué)防治等。斜紋夜蛾核多角體病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）能特異高效地控制斜紋夜蛾種群，已被中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)成為商品化病毒殺蟲劑[11]。桿狀病毒作為生物殺蟲劑，相較于化學(xué)殺蟲劑具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：宿主專一不傷害人畜，不會(huì)產(chǎn)生殘余物污染環(huán)境，不會(huì)引起昆蟲產(chǎn)生抗性。但桿狀病毒殺蟲劑具有殺蟲譜太窄、殺蟲速度緩慢等缺點(diǎn)，因此其應(yīng)用受到限制。深入了解病毒基因的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步研究其致病機(jī)理，為遺傳改良桿狀病毒殺蟲劑以擴(kuò)大其殺蟲譜和提高其殺蟲效率提供了重要的理論指導(dǎo)。

SpltMNPV屬桿狀病毒科核多角體病毒屬，基因組全長139 342 bp，含有141個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）[12]。到目前為止，在所有已測序的桿狀病毒基因組中發(fā)現(xiàn)38個(gè)核心基因[13-16]，SpltMNPV ORF75（Splt75）是桿狀病毒核心基因之一，其在苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）中的同源基因ORF78（Ac78）在桿狀病毒的生活周期中具有重要作用[17]，但其作用機(jī)理未知。蛋白結(jié)構(gòu)與功能息息相關(guān)，本研究選取到目前為止尚未見研究報(bào)道的Splt75作為研究對象，利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析Splt75基因及其編碼蛋白Splt75的結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步揭示Splt75的功能和作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

SpltMNPV G2毒株，由中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送提供，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

pMD18-T Vector、Taq酶，購自TaKaRa公司；氨芐青霉素，購自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶，購自New England BioLabs公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒，購自O(shè)mega公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 SpltMNPV基因組DNA的提取

參照文獻(xiàn)[18]的方法，從SpltMNPV多角體中提取病毒基因組DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及克隆

根據(jù)Genbank登錄的SpltMNPV G2株基因組全序列[12]（AF325155）中的Splt75基因全長序列，設(shè)計(jì)一對引物擴(kuò)增Splt75基因，由廣州擎科生物技術(shù)有限公司合成。上游引物PF：5'-GAGCTCATGAATTT GGACGTACCCTACGA-3'，下游引物 PR：5'-GGATC CCTAAATGTACAAAGAGTCGGGAC-3'，下劃線部分分別為引入的SacI和BamHI酶切位點(diǎn)。以所提取的SpltMNPV基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆入pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取并過夜培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，并在廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，比較測序結(jié)果與Splt75基因序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用DNASTAR軟件推導(dǎo)出測序得到的Splt75基因序列編碼蛋白Splt75的氨基酸序列，應(yīng)用在線工具ExPASy ProParam（https://web.expasy.org/protparam）分析Splt75蛋白的分子式、氨基酸組成和相對分子量等理化性質(zhì)。蛋白質(zhì)的親疏水特性預(yù)測使用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale），蛋 白 質(zhì)信號肽的檢測使用SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP），蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與模式的預(yù)測使用 TMHMM Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）、MotifScan（https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan） 和 Psort（http://www.genscript.com/psort.html）等在線軟件。利用NCBI Conserved Domain Search搜索工具搜索Splt75的保守區(qū)域。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線軟件進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測利用SWISS-MODEL在線工具（https://www.swissmodel.expasy.org）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Splt75基因的克隆

以所提取的SpltMNPV基因組DNA為模板，從SpltMNPV基因組中PCR擴(kuò)增出一條特異的363 bp左右的片段，克隆入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，培養(yǎng)陽性克隆，提取質(zhì)粒，用SacI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得與預(yù)期相符的363 bp的目的片段和2 692 bp的載體片段（圖1），質(zhì)粒命名為T-Splt75。T-Splt75的測序結(jié)果顯示，pMD18-T載體中的插入片段與Genbank登錄的SpltMNPV G2株基因組全序列（AF325155）中的Splt75基因全長序列完全一致，沒有發(fā)生堿基突變。

圖1 重組質(zhì)粒T-Splt75的鑒定

2.2 Splt75蛋白的理化性質(zhì)分析

通過DNASTAR軟件和在線軟件ExPASy ProParam （https://web.expasy.org/protparam） 分 析Splt75基因編碼蛋白Splt75的理化性質(zhì)。Splt75蛋白由120個(gè)氨基酸組成（圖2），其中纈氨酸（Val）13個(gè)、亮氨酸（Leu）12個(gè)，含量相對較高，分別為10.8%和10.0%；共11個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸（Asp、Glu），占9.2%；12個(gè)帶正電荷氨基酸（Arg、Lys），占10.0%；預(yù)測相對分子質(zhì)量為13 137.16 Da，蛋白等電點(diǎn)為7.86，分子式為C583H942N160O174S5。Splt75蛋白的半衰期為30 h；不穩(wěn)定指數(shù)為37.4（小于40），是穩(wěn)定蛋白。

2.3 Splt75蛋白的疏水性分析

運(yùn)用 ProtScale（https://web.expasy.org/protscale）在線軟件分析Splt75蛋白的親疏水性，結(jié)果如圖3所示。Splt75蛋白第103位的精氨基（Arg）分值最低，為-3.189，第83位的亮氨酸（Leu）和84位的半胱氨酸（Cys）的分值最高，為3.989，在74～97氨基酸區(qū)域存在疏水區(qū)域，Splt75蛋白總體表現(xiàn)為疏水。

圖2 Splt75的氨基酸組成

圖3 Splt75的親疏水性分析

2.4 Splt75的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽預(yù)測

使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）預(yù)測Splt75蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，結(jié)果如圖4所示。在Splt75蛋白的76～98氨基酸區(qū)域存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。利 用 SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在線預(yù)測顯示Splt75蛋白無信號肽，Psort（http://www.genscript.com/psort.html）在線預(yù)測顯示Splt75蛋白C末端無KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號模序、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜滯留信號模序和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回運(yùn)信號類似模序（Endoplasmic Reticulum Retrieval Signals） （KKXX-like motif）。

圖4 Splt75的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)分析

2.5 Splt75的蛋白序列模式預(yù)測

運(yùn)用Motif Scan（https://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）對Splt75蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。Splt75蛋白中可能含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（59～62），1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（30～33），1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（32～34），1個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)（35～40），1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（104～107），1個(gè)酰胺化位點(diǎn)（100～103）。

利用NCBI Conserved Domain Search搜索工具發(fā)現(xiàn)Splt75屬于ORF78（Ac78）超家族成員（圖5），該家族成員由AcMNPV ORF78及其同源的桿狀病毒蛋白組成。

表1 Splt75蛋白序列模式分析結(jié)果

圖5 Splt75的保守區(qū)域預(yù)測

2.6 Splt75的二級結(jié)構(gòu)

運(yùn)用在線軟件SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析Splt75蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示。Splt75二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件是α螺旋和無規(guī)則卷曲。其中α螺旋由48個(gè)氨基酸構(gòu)成，占總氨基酸的40.00%，無規(guī)則卷曲由52個(gè)氨基酸構(gòu)成，占總氨基酸的43.33%，18個(gè)氨基酸參與形成延伸鏈，占比15.00%，β轉(zhuǎn)角由2個(gè)氨基酸構(gòu)成，占比1.67%。

圖6 Splt75二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.7 Splt75的三級結(jié)構(gòu)

運(yùn)用SWISS-MODEL在線工具（https://www.swissmodel.expasy.org）構(gòu)建Splt75蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖7所示。GMQE評分為0.16（質(zhì)量評估的數(shù)字越大，結(jié)果越可靠），QMEAN評分為-2.25（基于不同幾何特性的符合評估，分?jǐn)?shù)≤-0.4表示一致性較差，模型可靠度較差）。

圖7 Splt75三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SpltMNPV的Splt75是桿狀病毒核心基因，NCBI Conserved Domain Search搜索工具發(fā)現(xiàn)，Splt75屬于ORF78（Ac78）超級家族成員，與Ac78的序列一致性為32%，表明Splt75可能具有與Ac78相似的功能。前期對Ac78的研究發(fā)現(xiàn)，Ac78蛋白是桿狀病毒的一個(gè)多功能蛋白，主要參與BV的產(chǎn)生、多粒包埋ODV （multiple nucleocapsid-enveloped ODV，M-ODV）的形成和病毒在粉紋夜蛾幼蟲體內(nèi)起始初始感染的過程。Ac78的缺失導(dǎo)致BV和M-ODV的產(chǎn)量顯著下降以及病毒在粉紋夜蛾幼蟲體內(nèi)起始初始感染能力的喪失，Ac78的氨基酸2～25和64～88區(qū)域在其所有旁系同源物（ortholog）中高度保守，是Ac78的關(guān)鍵區(qū)域[17]。

生物信息學(xué)是預(yù)測蛋白質(zhì)功能以及分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的重要方法，在醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[19]。通過生物信息學(xué)分析，Splt75蛋白由120個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為13 137.16 Da，蛋白等電點(diǎn)為7.86，性質(zhì)穩(wěn)定，總體表現(xiàn)為疏水。Splt75蛋白無信號肽，存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，無KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號模序、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜滯留信號模序和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回運(yùn)信號類似模序（KKXX-like motif）。前期研究中通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在Ac78的C末端存在一個(gè)可能的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回運(yùn)信號類似模序（KKXX-like motif），通過構(gòu)建缺失Ac78 KKXX-like模序的重組病毒vAc78:del105-108研究發(fā)現(xiàn)，該模序在Ac78功能和在感染細(xì)胞中定位非必需[20]，這與該模序在Ac78的同源蛋白中并不保守相一致。

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活力與功能具有非常重要的作用[21]。通過對Splt75的蛋白序列模式預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Splt75有N-糖基化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、蛋白激酶C磷酸、N-豆蔻?；AMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化和酰胺化等多個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)。在Ac78中，經(jīng)預(yù)測可能存在2個(gè)N-糖基化和1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化翻譯后修飾位點(diǎn)（文中未顯示），表明N-糖基化位點(diǎn)和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)在Splt75及其同源蛋白中相對保守，可能在Splt75及其同源蛋白的功能中具有重要作用。對Splt75的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，α螺旋和無規(guī)則卷曲為Splt75的主要結(jié)構(gòu)。α螺旋的存在有利Splt75蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，α螺旋占比40.00%，說明Splt75可能相對保守，這與Splt75是桿狀病毒核心基因相符。無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的存在區(qū)域可能是Splt75發(fā)揮功能的重要區(qū)域，無規(guī)則卷曲占比43.33%，說明Splt75可能在桿狀病毒生活周期中具有重要作用。

3 結(jié)論

Splt75基因編碼120個(gè)氨基酸，編碼蛋白Splt75分子量為13 137.16 Da，蛋白理論等電點(diǎn)為7.86，分子式為C583H942N160O174S5，是穩(wěn)定的疏水蛋白；Splt75蛋白中無信號肽，存在跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，C末端無KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號模序、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜滯留信號模序和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回運(yùn)信號類似模序；可能含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)、1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)以及1個(gè)酰胺化位點(diǎn)；屬于ORF78（Ac78）超家族成員；Splt75的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件。本研究結(jié)果可靠，為進(jìn)一步研究Splt75在桿狀病毒生活周期中的功能和作用機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。