楊子平 孫藝桓 楊倩 鹿志偉 張燕梅 李俊峰 周文釗

摘 ?要：植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通過蛋白質(zhì)相互作用參與調(diào)控落果、纖維細胞發(fā)育、次生細胞壁發(fā)育、開花等事件。為篩選劍麻葉中與AhKNOX2相互作用的蛋白，采用SMART同源重組技術(shù)構(gòu)建劍麻葉片酵母雙雜交表達文庫，利用AhKNOX2為誘餌篩選與之相互作用的蛋白。結(jié)果表明：文庫總?cè)萘繛?.9106 CFU，轉(zhuǎn)化效率為9.15105 CFU/μg pGADT7-Rec，插入片段大小主要分布于0.5～3.0 kb之間，重組率為92%，保存的文庫細胞密度為1.35108/mL，文庫滴度為2.22107 CFU/mL。構(gòu)建的pGBKT7-AhKNOX2誘餌載體存在自激活性，5 mmol/L的3-氨基- 1，2，4-三唑（3-Amino-1，2，4-triazole，3-AT）能抑制誘餌載體的自激活，通過篩選獲得了16個與AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功構(gòu)建劍麻葉片酵母表達文庫，并篩選獲得與AhKNOX2相互作用的蛋白，該結(jié)果為進一步研究AhKNOX2在劍麻中的功能奠定前期基礎(chǔ)，為培育高纖維產(chǎn)量的劍麻新品種提供基因資源和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：劍麻;AhKNOX2;酵母雙雜交;cDNA文庫;蛋白質(zhì)相互作用

中圖分類號：S563.8;Q78 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： To obtain the proteins interacting with AhKNOX2 in Agave hybrid No.11648， a full length-expression cDNA library was constructed in yeast strain Y187 using homologous recombination-mediated SMART technology. The capacity of the cDNA library was 3.9×106 CFU and the transformation efficiency was about 9.15×105 CFU/μg pGADT7-Rec. The PCR amplification of 24 clones randomly selected from the cDNA library indicated that the length of most inserts was ranged from 0.5 kb to 3.0 kb， with a recombination rate of 92%. The cell density was 1.35×108/mL and the titer was up to 2.22×107 CFU/mL. The bait vector （pGBKT7-AhKNOX2） was transformed into yeast strain Y2HGold， colonies appeared on SD/-Trp/-His media and was inhibited by 5 mmol/L 3-AT. After screening the library using bait plasmids，a total of 16 proteins interacting with AhKNOX2 were obtained by sequencing and homology analysis. In conclusion， a high-quality cDNA library was constructed and 16 proteins interacting with AhKNOX2 were screened from cDNA library.

Keywords： Agave hybrid; AhKNOX2; yeast two-hybrid; cDNA library; protein-protein interaction

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.004

同源異型盒基因（homeobox genes）廣泛存在于真核生物中，編碼一類含有保守同源異型盒結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）的轉(zhuǎn)錄因子，在生物個體形態(tài)建成、生殖發(fā)育、細胞命運、非生物脅迫等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1-6]。KNOX亞家族幾乎存在于所有植物中，其編碼蛋白N端至C端依次存在MEINOX、GSE、ELK、HD 4個保守結(jié)構(gòu)域，MEINOX（包含KNOX1和KNOX2結(jié)構(gòu)域）和ELK結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)間的相互作用有關(guān)，核定位信號位于ELK結(jié)構(gòu)域，GSE結(jié)構(gòu)域涉及泛素降解途徑調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性，HD位于蛋白的C端[7]。由于在植物中的表達模式和基因中內(nèi)含子位置存在差異，KNOX亞家族被進一步分為ClassⅠ和ClassⅡ 2大亞家族[8]。ClassⅠ類亞家族主要在分生組織中表達，是分生組織發(fā)生與維持所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄基因，參與側(cè)生器官的形態(tài)建成[9-10]、調(diào)控激素[11-12]和木質(zhì)素合成[13-14];ClassⅡ類亞家族在所有植物組織均有表達，目前發(fā)現(xiàn)調(diào)控植物次生細胞壁形成和纖維的發(fā)育[15-17]。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)KNOX成員可通過蛋白質(zhì)相互作用，形成復(fù)合物調(diào)控植物細胞壁的形成、木質(zhì)素的合成、細胞壁的擴張和加固[18-21]。Abraham- Juárez等[22]首次報道了劍麻中2個Ⅰ類KNOX基因。接著Zhou等[23]研究發(fā)現(xiàn)一個Ⅰ類KNOX基因在莖尖分生組織和幼齡的葉片中高表達。Gross等[24]的研究結(jié)果則表明劍麻Ⅰ類KNOX基因在葉片基部表達，在葉片中上部不表達。劍麻KNOX2調(diào)控珠芽的發(fā)育，在珠芽發(fā)育的起始階段，劍麻KNOX2隨著珠芽的增大，表達量逐漸增加;在擬南芥中過表達劍麻KNOX2，導(dǎo)致葉出現(xiàn)裂片的表型;進一步發(fā)現(xiàn)劍麻KNOX2能夠回補擬南芥knat1突變表型[22]。植物KNOX基因參與葉片的形態(tài)建成和纖維的發(fā)育，初步推測劍麻KNOX2基因參與調(diào)控劍麻葉片和纖維的發(fā)育。因此，本課題組克隆了國內(nèi)主栽品種H.11648（Agave hybrid No.11648）的AhKNOX2基因，構(gòu)建劍麻葉片酵母雙雜交cDNA表達文庫，篩選與AhKNOX2相互作用的蛋白，從蛋白質(zhì)相互作用的角度研究AhKNOX2基因在劍麻葉片中的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果為培育高纖維產(chǎn)量的劍麻新品種提供基因資源和理論基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

劍麻H.11648采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所劍麻種質(zhì)保存圃;RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Hi-Fusion試劑盒、Nde I和BamH I購自江蘇愚公生命科技有限公司;雙鏈cDNA純化、酵母轉(zhuǎn)化和文庫構(gòu)建試劑盒購自Clontech公司;用于配制酵母培養(yǎng)基的試劑和其他試劑購自Sigma- Aldrich公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取 ?采集H.11648品種5齡植株葉樣品，液氮速凍。將樣品研磨成粉，按照華越洋多糖多酚RNA提取試劑盒操作，取50～100 mg樣品提取其總RNA。

1.2.2 ?RNA的反轉(zhuǎn)錄 ?反轉(zhuǎn)錄按照愚公生物M- MLV GIII First-Strand Synthesis Kit操作。反應(yīng)體系中加入1.0 μL CDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物，以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得帶同源重組接頭的單鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序為：55 ℃30 min;85 ℃ 1 min。CDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物序列見表1。

1.2.3 ?雙鏈cDNA的合成 ?以反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，加入5 PCR引物和3 PCR引物（表1），利用Advantage 2 Polymerase Mix合成雙鏈cDNA。PCR擴增條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min，68 ℃ 5 min，26個循環(huán)。

1.2.4 ?雙鏈cDNA的純化 ?預(yù)先將CHROMA SPINTM TE-400純化柱中膠體和緩沖液混合均勻，瞬時離心棄液體。將93 μL雙鏈cDNA加入純化柱膠體，700?g離心5 min。向收集液中加入2.5倍體積無水乙醇和1/10體積的3 mol/L乙酸鈉，置于20 ℃沉淀DNA。用20 μL無菌水溶解沉淀物，并測定雙鏈cDNA濃度。

1.2.5 ?文庫構(gòu)建 ?按照YeastmakerTM Yeast Trans-formation System 2操作制備酵母感受態(tài)細胞。取純化的雙鏈cDNA（2～5 μg）與3 μg線性化pGADT7-Rec質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y187酵母菌，轉(zhuǎn)化菌體用6 mL生理鹽水懸浮，每個平板100 μL，將懸浮液涂布于不含亮氨酸的綜合培養(yǎng)基（SD/-Leu）平板上，于30 ℃培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)平板于4 ℃放置 4 h，向平板加入5 mL液體酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPDA）（含25%的甘油），用涂布棒刮離酵母菌，收集菌體懸浮液。濃縮文庫體積，血球板計數(shù)法計算細胞密度，使文庫細胞密度大于2×107/mL。按每管1 mL，將濃縮液分裝于1.5 mL無菌管中，保存于80 ℃。

1.2.6 ?文庫質(zhì)量檢測 ?取100 μL懸浮液用生理鹽水逐步稀釋10倍和100倍，取100 μL稀釋液涂布SD/-Leu平板，30 ℃培養(yǎng)5 d。采用ImageJ軟件統(tǒng)計生長菌落數(shù)。按照如下公式分別計算文庫容量和轉(zhuǎn)化效率：

挑取SD/-Leu平板上的菌落，利用pGADT7- Rec的載體引物PCR鑒定插入片段。PCR擴增條件為：95 ℃ 10 min;95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，55 個循環(huán);72 ℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照如下公式計算重組率：

取10 μL文庫保存液懸浮于1 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，混合均勻得稀釋液A（稀釋度102）。從稀釋液A中吸取10 μL懸浮液加入1 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，混合均勻得稀釋液B（稀釋度104）。分別從稀釋液A和稀釋液B中取10 μL和50 μL懸浮液涂布于SD/-Leu平板，30 ℃培養(yǎng)5 d。采用ImageJ軟件統(tǒng)計生長菌落數(shù)。按照如下公式計算文庫滴度：

1.2.7 ?誘餌載體構(gòu)建 ?設(shè)計攜帶Nde I和BamH I酶切位點的特異引物（表1），擴增AhKNOX2編碼框。將AhKNOX2編碼框插入pGBKT7載體，構(gòu)建誘餌載體。誘餌載體雙酶切檢測并送測序。

1.2.8 ?誘餌載體自激活檢測及3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）抑制濃度篩選 ?將pGBKT7-AhKNOX2載體轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌株，轉(zhuǎn)化液分別涂布于不含色氨酸的綜合培養(yǎng)基（SD/-Trp）、SD/-Leu、不含色氨酸和腺嘌呤的綜合培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Ade）和不含色氨酸和組氨酸的綜合培養(yǎng)基（SD/-Trp/-His）平板，30 ℃培養(yǎng)5 d，以檢測誘餌載體是否具有自激活性。將攜帶有誘餌載體的Y2HGold酵母菌株涂布于含不同濃度的3-AT的SD/-Trp/-His平板，30 ℃培養(yǎng)5 d，以確定3-AT的抑制濃度。

1.2.9 ?互作蛋白篩選 ?使用50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基擴大含誘餌載體的Y2HGold酵母菌株，收集菌體與1 mL文庫菌體混合于50 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)20～24 h。收集菌體，使用10 mL 0.5×YPDA液體培養(yǎng)基懸浮共培養(yǎng)的菌體，并涂布于含3-AT的SD/-Trp/-Leu/-His平板，30 ℃培養(yǎng)5 d。篩選平板長出的菌落進行挑取，轉(zhuǎn)接3次到SD/-Trp/-Leu/-His平板上。挑取剩下活的菌落，接種于SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)20～24 h，收集菌體提取酵母質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌并提取質(zhì)粒送測序。

1.2.10 ?陽性克隆cDNA的注釋 ?采用本地Blast的方式，將測序獲得的陽性克隆cDNA序列與劍麻H.11648的轉(zhuǎn)錄組序列進行比對，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組的注釋信息，獲得候選互作蛋白的功能等信息。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?總RNA的提取

提取的劍麻總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果顯示28S和18S條帶清晰，RNA未降解（圖1A）;OD260/OD280比值為1.95，表明提取的總RNA純度和質(zhì)量較高，可用于后續(xù)實驗。

2.2 ?cDNA的合成及純化

分別在合成雙鏈cDNA的第21～26個循環(huán)取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果顯示，第21和第22個循環(huán)的PCR產(chǎn)物不明顯，從第23個循環(huán)開始，PCR產(chǎn)物明顯且濃度逐漸增加（圖1B）。合成的cDNA片段分布于0.2～5.0 kb之間，且主要集中在1.0 kb左右。對第26個循環(huán)合成的雙鏈cDNA進行純化，純化的雙鏈cDNA中0.5 kb以下小片段含量明顯降低（圖1C），純化的雙鏈cDNA總量為4.26 μg（213 ng/μL）。

2.3 ?文庫構(gòu)建及質(zhì)量檢測

Image J軟件統(tǒng)計100 μL 102倍的文庫稀釋液在SD/-Leu平板上平均長出了650個單菌落（圖2A），文庫總?cè)萘繛?.9106 CFU，轉(zhuǎn)化效率為9.15105 CFU/μg pGADT7-Rec。100倍稀釋液經(jīng)鏡檢，80個小格共計27個酵母細胞，文庫細胞密度為1.35×108/mL。Image J軟件統(tǒng)計50 μL 104倍的文庫稀釋液在SD/-Leu平板上平均長出了111個單菌落（圖2B），文庫滴度為2.22107 CFU/ mL。菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果顯示插入片段在0.5～3.0 kb之間，少量酵母菌含有多個重組質(zhì)粒（圖2C），重組率為92%。

2.4 ?誘餌載體構(gòu)建

pGBKT7-AhKNOX2載體經(jīng)Nde I和BamH I內(nèi)切酶雙酶切出現(xiàn)900 bp左右條帶（圖3A），測序結(jié)果表明，插入片段即為AhKNOX2的編碼框，雙酶切和測序結(jié)果說明誘餌載體構(gòu)建成功。

2.5 ?自激活檢測

陽性對照可在4個培養(yǎng)基上生長（p53蛋白和T-antigen相互作用）。陰性對照僅在SD/-Trp和SD/-Leu培養(yǎng)基上生長（Lam和T-antigen不相互作用）?？蛰d體對照（pGBKT7）僅能在SD/-Trp培養(yǎng)基上生長。含有pGBKT7-AhKNOX2載體的Y2HGold酵母可在SD/-Trp培養(yǎng)基生長，在SD/-Leu和SD/-Trp/-Ade培養(yǎng)基上不生長，但在SD/-Trp/- His培養(yǎng)基上生長了少量的菌落（圖3B），結(jié)果表明，誘餌載體沒有激活報告基因ADE2的表達，但激活了報告基因HIS3的表達，存在自激活性。

2.6 ?3-AT抑制濃度篩選

由于KNOX2存在自激活性，能激活His的表達，使Y2HGold酵母能在缺His（組氨基酸）的培養(yǎng)基生長，因此，采用在培養(yǎng)基中加入3-AT來抑制自激活。含有pGBKT7-AhKNOX2載體的Y2HGold酵母能在不含3-AT的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上生長，而在加了5 mmol/L及更高濃度3-AT的SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上不能生長（圖4）。由此可知，5 mmol/L的3-AT就能抑制誘餌載體的自激活性。

2.7 ?互作蛋白篩選

經(jīng)SD/–Trp/–Leu/–His/+5 mmol/L 3-AT培養(yǎng)基的篩選，獲得16個與AhKNOX2相互作用的陽性克隆，將陽性克隆cDNA測序序列與劍麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對，獲得與AhKNOX2相互作用蛋白的cDNA注釋信息（表2）。根據(jù)候選蛋白的功能，可分為蛋白/DNA結(jié)合蛋白、蛋白/RNA結(jié)合蛋白、核苷酸結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)加工、碳水化合物代謝、光形態(tài)建成和未知蛋白8大類。

3 ?討論

酵母雙雜交是目前能夠高通量篩選相互作用蛋白的技術(shù)之一。但大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子具備轉(zhuǎn)錄激活功能，這就導(dǎo)致構(gòu)建的誘餌載體往往存在自激活，因此抑制誘餌載體的自激活是降低假陽性的關(guān)鍵之一。本研究采用的是Clontech公司的Matchmaker? Gold酵母雙雜交系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用3個異源的Gal4響應(yīng)啟動子元件（G1、G2和M1）控制HIS3、ADE2、MEL1/AUR1-C 4個報告基因的表達，目的是通過增加報告基因來降低篩選結(jié)果的假陽性。3-AT是HIS3蛋白的競爭性抑制劑，能夠抑制組氨酸的合成[25-26]。如果在實驗過程中發(fā)現(xiàn)誘餌載體存在自激活，可通過在篩選培養(yǎng)基中增加3-AT來抑制由誘餌蛋白激活表達的HIS3蛋白的活性，減少自激活背景[27]。本實驗發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pGBKT7-AhKNOX2存在自激活性，啟動了HIS3報告基因的表達，向SD/–Trp/–His培養(yǎng)基中添加5 mmol/L的3-AT能抑制其自激活能力，因此將SD/–Trp/–Leu/–His/+5 mmol/L 3-AT培養(yǎng)基作為文庫篩選培養(yǎng)基。

KNOX蛋白能形成同源或者異源二聚體，通過改變亞細胞定位實現(xiàn)調(diào)控作用。從KNOX蛋白的結(jié)構(gòu)域功能看，MEINOX結(jié)構(gòu)域?qū)π纬啥垠w起重要作用，ELK結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)之間的相互作用，而HD結(jié)構(gòu)域參與DNA的結(jié)合和同源二聚體的形成[7]，表明KNOX蛋白能形成同源或者異源二聚體，而蛋白質(zhì)相互作用往往會改變復(fù)合體的亞細胞定位。研究發(fā)現(xiàn)，KNOX與BELL相互作用形成異源二聚體，進入細胞核，從細胞質(zhì)移動到細胞核依賴于二者形成復(fù)合物[28]。擬南芥OFPs（Arabidopsis thaliana ovate family proteins）與KNAT1蛋白相結(jié)合，將KNAT1蛋白從細胞核中移動至細胞質(zhì)中的微管上[29]。KNATM與KNOX的結(jié)合，阻止了KNOX進入細胞核[30]。本研究通過酵母雙雜交篩選獲得16個與AhKNOX2相互作用的候選蛋白，16個候選蛋白中沒有同源異型盒基因家族蛋白，表明AhKNOX2與候選蛋白形成異源二聚體發(fā)揮作用。

KNOX可通過蛋白質(zhì)相互作用參與調(diào)控植物發(fā)育的多個事件，目前發(fā)現(xiàn)與KNOX相互作用的蛋白主要是轉(zhuǎn)錄因子，如與SH5相互作用抑制木質(zhì)素的合成，調(diào)控落果[20];與OFP和MYB轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控纖維細胞和次生細胞壁發(fā)育[16-17， 19];與NAC直接相互作用，抑制其下游基因CESAs等的表達，調(diào)控細胞壁加厚[21];與水稻生長調(diào)控因子GRF4互作，抑制其下游基因Expansin等的表達，調(diào)控細胞擴展[21];與KNOX同源蛋白間相互作用，調(diào)控開花[31-32]。本研究通過篩選，一共獲得16個陽性克隆，其中3個為轉(zhuǎn)錄因子（MADS、VOZ、bHLH），AhKNOX2與這些蛋白的相互作用在劍麻中的具體功能還有待深入研究。

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