★ 張嘉嘉 黃曉萱 馬馳 楊漪 張勛*（福建中醫(yī)藥大學藥學院 福州 350122）

赤芍為毛茛科芍藥（Paeonia lactifloraPall）或川赤芍（P.veitchiiLynch）的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效［1］。赤芍主要含有兩大類化學成分，即苷類和沒食子酸及其衍生物，苷類主要活性成分有芍藥苷、芍藥內酯苷、氧化芍藥苷等［2］。其中，芍藥苷含量最高，《中國藥典》中也是以芍藥苷作為藥材質量檢測的目標成分。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷具有擴張血管、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗炎、抗?jié)兊淖饔茫?-4］；芍藥內酯苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、補血、抗抑郁等功效［5］；沒食子酰葡萄糖具有抗癌、抗糖尿病等生物學活性［6-7］；沒食子酸具有明顯的抗氧化、抗炎等作用［8］?！吨袊幍洹?015版一部主要以芍藥苷的含量控制赤芍藥材的質量，但是單一的成分控制無法從整體水平控制赤芍的質量。建立快捷、方便、可靠的同時測定多種赤芍活性成分檢測方法對赤芍藥材的質量控制具有重要意義。故本實驗選擇芍藥苷、芍藥內酯苷、氧化芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖以及沒食子酸5種成分作為質量控制指標，分別測定了20個不同產(chǎn)地的赤芍中5種成分的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DF-15臺式連續(xù)投料粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；AR224CN型電子分析天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；MILLI-Q Direct16 一體化超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 材料 赤芍對照藥材（批號：120915-201109，中國食品藥品質量檢定研究院）；沒食子酸（批號：B20851，上海源葉生物科技有限公司）；氧化芍藥苷（批號：YY90574，上海源葉生物科技有限公司）；芍藥內酯苷（批號：YY90477，上海源葉生物科技有限公司）；芍藥苷（批號：B21148，上海源葉生物科技有限公司）；β-五沒食子酰葡萄糖（批號：P816672，上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（默克化工技術有限公司）；實驗用水皆為實驗室自制二次蒸餾水。20批赤芍飲片中Cs2015121401—Cs2015121419為赤芍飲片，Cs2015121420為赤芍對照藥材，均經(jīng)過福建中醫(yī)藥大學藥學院黃澤豪老師鑒定）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性 Welch Ultimate?XBC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫，0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～15%A ；30～45 min，15%～30%A。流速1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。5個對照品分離度良好，各峰的分離度均大于1.5。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5種活性成分對照品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖適量，加甲醇超聲溶解制 成 346.8、319.6、198.0、366.8、353.6 μg/mL 的沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋得每1 mL含173.4、159.8、99.01、183.4 和 88.4 μg上述 5 種成分的混合對照品溶液，即得，4 ℃下保存于冰箱中。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末過80目篩，精密稱取0.25 g，置25 mL具塞三角燒瓶中，精密加入80%甲醇超聲處理（功率240 W，溫度60 ℃）30 min，放冷，補足失重。過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線 精密吸取“2.2”項下的混合對照品儲備液于20 mL量瓶中，依次對半稀釋得不同濃度的對照品混合液。按“2.1”項測定，以對照品的濃度（C，μg/mL）為橫坐標（X），峰面積（A，mAU）為縱坐標（Y），分別繪制5個對照品的標準曲線，得到回歸方程和相關系數(shù)，結果見表1。

表1 5種化合物的線性回歸方程

2.4.2 精密度 取對照品混合液5 μL，按“2.1”項進行測定。一天內連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為0.57%、0.68%、0.11%、0.33%、1.2%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性 精密稱取同一份赤芍樣品（批號：Cs20151216-18），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫環(huán)境下分別在0、2、4、8和12 h時進樣5 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為2.57%、2.68%、2.37%、1.23%、2.41%，表明赤芍供試品溶液中各成分在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性 精密稱取同一份赤芍樣品（批號：Cs20151216-18），平行6份，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定各成分的峰面積。結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖峰面積的RSD分別為2.52%、2.31%、1.95%、1.07%、1.23%，5種成分峰面積的RSD均小于3%，表明本方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的赤芍樣品粉末6份，分別加入樣品含量50%的對照品溶液，按“2.3”項方法制備供試品溶液，并按“2.1”項色譜條件進樣，記錄峰面積，計算平均加樣回收率，結果沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的平均加樣回收率分別為100.21%、99.83%、100.22%、101.94%、100.79%，RSD分別為2.04%、2.21%、2.56%、1.01%、2.35%。

2.5 樣品測定 分別取赤芍樣品粉末約0.25 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，采用標準曲線法計算沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的含量，結果如表2所示。

表2 20批赤芍樣品5種成分含量 %

（續(xù)表）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 將混合對照品溶液進行190 nm～400 nm紫外可見光全波長掃描，分別在250 nm和230 nm附近出現(xiàn)兩個吸收峰，沒食子酸、氧化芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的最大吸收峰并不在230 nm，但方法學考察結果表明它們在230 nm有著很好的線性關系，可以用來定量檢測，且發(fā)現(xiàn)在230 nm下各色譜峰的數(shù)目、分離度、豐度較好，故本研究選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 色譜條件考察 為尋求最佳色譜條件，本實驗先后考察了不同提取溶劑、不同提取方式、不同提取時間、不同柱溫、不同流速、不同流動相體系，結果表明，色譜條件選擇Welch Ultimate?XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈和0.1%甲酸，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，80%甲醇處理30 min，各色譜峰的峰形、分離度較好。

4 結論

本文建立HPLC法，測定赤芍中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、β-五沒食子酰葡萄糖的含量。2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，赤芍飲片含芍藥苷不得少于1.5 %，20批藥材全部合格，但與對照藥材相比，部分產(chǎn)地芍藥內酯苷的含量過高，是對照藥材的6～100倍，此外，各個產(chǎn)地的β-五沒食子酰葡萄糖含量均高于對照藥材，因此，僅僅用芍藥苷作為赤芍的指標性成分，專屬性不強，不足以反映白芍的總體質量。故本實驗通過對赤芍沒食子酸等5種成分含量的研究，初步對赤芍的質量進行了考察，方法簡單，結果可靠，重復性好，為赤芍整體質量控制評價體系的建立提供了科學實驗基礎。