譚 琳，胡潤鵬，鐘慧君，肖利娟,2**，雷臘梅，韓博平

(1:暨南大學(xué)水生生物研究中心，廣州 510632) (2:廣東省水庫藍(lán)藻水華防治中心，廣州 510632)

擬柱孢藻(Cylindrospermopsisraciborskii)和角星鼓藻(Staurastrumspp.)是熱帶和亞熱帶水體的常見優(yōu)勢種類，2個(gè)種類存在演替現(xiàn)象. 例如，Ndebele-Murisa等對非洲湖泊研究的綜述中指出，絲狀藍(lán)藻(擬柱孢藻、長孢藻、假魚腥藻)常在雨季開始之前成為浮游植物群落的優(yōu)勢類群，鼓藻目種類(鼓藻、角星鼓藻)常在雨季常成為優(yōu)勢種類[1]；Barbosa和Padisk在巴西多座湖泊中發(fā)現(xiàn)角星鼓藻在分層時(shí)期成為浮游植物群落中的絕對優(yōu)勢種，擬柱孢藻在去分層時(shí)期常成為優(yōu)勢種[2].對海南的赤田水庫、廣東的大沙河、高州等多座水庫的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，擬柱孢藻是這些水庫的優(yōu)勢種，但通常在水體去分層時(shí)期形成優(yōu)勢，而在水體強(qiáng)分層時(shí)期浮游植物群落以角星鼓藻為絕對優(yōu)勢種[3-5]. 擬柱孢藻是熱帶亞熱帶水庫中常見的水華藍(lán)藻，具有產(chǎn)毒能力，已有研究表明擬柱孢藻對常量元素(N和P)具有較強(qiáng)的競爭能力，尤其能適應(yīng)低磷環(huán)境[6]. 角星鼓藻為單細(xì)胞綠藻，細(xì)胞個(gè)體大，能耐受資源脅迫，對低磷環(huán)境有很好的適應(yīng)性[3-4]. 已有的研究主要集中在大量元素對2種藻類生長的影響上，對微量元素的影響尚缺乏充分的認(rèn)識，而基于常量元素的競爭能力能夠解釋擬柱孢藻占優(yōu)勢卻不能很好地解釋其相對生物量受到限制.

鐵是浮游植物生長需求最大的微量元素，主要分布于浮游植物細(xì)胞的光合系統(tǒng)中[7-10]. 光合系統(tǒng)中鐵含量占整個(gè)細(xì)胞總鐵含量的50%～90%，浮游植物鐵需求的種間差異主要由光合系統(tǒng)PSI(含12個(gè)Fe原子)和PSII(含2～3個(gè)Fe原子)的比例決定[7]. 藍(lán)藻比綠藻具有更高的PSI∶PSII比，因此鐵需求更高[8-10]. 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，相對于小球藻、柵藻等綠藻，微囊藻、顫藻等藍(lán)藻的生長更容易受鐵濃度影響，在低鐵濃度下的比生長速率明顯降低[11-13]. 在鐵限制條件下，浮游植物能產(chǎn)生高效鰲合鐵離子的鐵載體，同時(shí)在細(xì)胞外膜上產(chǎn)生鐵受體蛋白，特異性識別鐵離子—鐵載體復(fù)合物，并將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)從而緩解鐵限制，因此鐵載體產(chǎn)量常用于指示細(xì)胞受到鐵限制狀態(tài)[14-16].

在自然水體中，鐵是否能成為限制性資源，不僅取決于浮游植物的鐵需求，還取決于水體中鐵的生物可利用性[17-19]. 浮游植物生長主要在真光層，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，熱帶水庫真光層中總鐵濃度常低于0.5 mg/L，溶解性鐵濃度常低于0.1 mg/L[20]. Morton等[21]提出，水體中總鐵濃度低于0.1 mg/L時(shí)，藍(lán)藻生長受到限制. 此外，熱帶水庫中磷主要以有機(jī)顆粒態(tài)形式存在，溶解性活性磷濃度普遍低于0.01 mg/L，有機(jī)磷的利用能力對維持浮游植物生長有重要的作用[22]. 在無機(jī)磷不足的環(huán)境中，通過產(chǎn)生堿性磷酸酶水解有機(jī)磷是浮游植物利用有機(jī)磷源的主要途徑，這一過程中的能量傳遞、氮的利用都需要鐵的參與[7,23]. 基于藍(lán)藻和綠藻的鐵需求差異，我們推測在熱帶水庫鐵濃度范圍內(nèi)，鐵對擬柱孢藻和角星鼓藻生長的限制性作用存在差異，尤其在無機(jī)磷缺乏條件下，細(xì)胞鐵需求可能增加進(jìn)而導(dǎo)致鐵限制作用增強(qiáng).

為了驗(yàn)證以上推測，本文選擇具有擬柱孢藻和角星鼓藻季節(jié)演替現(xiàn)象的典型水庫(大沙河水庫)開展野外調(diào)查，分析鐵在擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對生物量季節(jié)動(dòng)態(tài)中的作用；并選取分離自熱帶水庫的擬柱孢藻(C.raciborskii, N8)和熱帶亞熱帶常見角星鼓藻(Staurastrumsp., FACHB-1449)為實(shí)驗(yàn)藻株，分別以無機(jī)磷和有機(jī)磷為磷源，以熱帶水庫湖上層鐵濃度值和Morton等[21]提出的藍(lán)藻生長受限制的鐵濃度閾值為參考依據(jù)，設(shè)置3個(gè)鐵濃度，開展鐵對2種藻生長作用的比較研究. 結(jié)合野外調(diào)查和室內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析鐵對擬柱孢藻和角星鼓藻生物量季節(jié)動(dòng)態(tài)和生長的作用，為進(jìn)一步闡明熱帶水庫擬柱孢藻和角星鼓藻的演替機(jī)制以及為擬柱孢藻水華的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

圖1 大沙河水庫采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites in Dashahe Reservoir

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查

1.1.1 水庫概況 大沙河水庫(22°32′N，112°30′E)位于廣東省開平市，是開平市區(qū)重要的供水水源地. 水庫流域面積217 km2，總庫容2.58×105m3，正常庫容1.57×103m3，最高水位34 m(珠基)，有效最低水位27.4 m(珠基).

1.1.2 采樣點(diǎn)設(shè)置與采樣頻率 在大沙河水庫敞水區(qū)設(shè)置采樣點(diǎn)(圖1)，從2016年8月-2017年8月，每月采樣1次.

用采水器采集水樣后，取1 L水樣現(xiàn)場加入1%魯哥試劑，帶回實(shí)驗(yàn)室，取10 mL水樣，采用倒置顯微鏡鏡檢法對浮游植物進(jìn)行種類鑒定和計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)400個(gè)藻類個(gè)體.

1.2 室內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 藻種來源與培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用藻種擬柱孢藻(C.raciborskii, N8)分離自廣東省江門市鎮(zhèn)海水庫；角星鼓藻(Staurastrumsp., FACHB-1449)購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，分離自一座亞熱帶富營養(yǎng)化水庫——湖北赤壁陸水湖水庫，為熱帶亞熱帶常見種. 將N8和FACHB-1449置于BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度25.5±1℃，光強(qiáng)35 μmol/(m2·s)，光照周期12 h∶12 h.

1.2.2 培養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以BG11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)(Fe3+濃度為0.689 mg/L)，以檸檬酸鐵銨為鐵源，依據(jù)熱帶水庫湖上層的鐵濃度范圍(<0.3 mg/L)[20]，共設(shè)置3種鐵濃度實(shí)驗(yàn)組：0.689 mg/L(IPHFe，即BG11對照組)，0.29 mg/L(IPMFe)，0.029 mg/L(IPLFe)；將BG11磷源替換為有機(jī)磷(OP, D-葡萄糖-6-磷酸)，以檸檬酸鐵銨為鐵源設(shè)置有機(jī)磷源條件下3種鐵濃度實(shí)驗(yàn)組：0.689 mg/L(OPHFe)，0.29 mg/L(OPMFe)，0.029 mg/L(OPLFe). 每個(gè)藻株各有6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(IPLFe、IPMFe、IPHFe、OPLFe、OPMFe和OPHFe)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行.

每天下午5點(diǎn)測定680 nm處的吸光值，確定培養(yǎng)藻細(xì)胞處于對數(shù)期之后，用離心法收集藻細(xì)胞，無菌水洗滌3次后將藻細(xì)胞接種至不含鐵、磷的BG11培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)3天，饑餓處理后的藻液分別接種至各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中，接種葉綠素a的初始濃度為17.90±1.95 μg/L. 培養(yǎng)條件為：溫度25.5±1℃，光強(qiáng)35 μmol/(m2·s)，光照周期12 h∶12 h. 每隔1天或3天于上午11點(diǎn)取樣，測定葉綠素a濃度、堿性磷酸酶活性和鐵載體產(chǎn)量，取1 mL藻液加魯哥試劑保存用于細(xì)胞計(jì)數(shù).

1.2.3 指標(biāo)測定 1)生長曲線和比生長速率的計(jì)算 取樣后遮光處理20 min，用TrilogyTMFluorpmeter熒光儀測定藻液葉綠素a熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成葉綠素a濃度(Chl.a濃度)[24]；取100 μL藻液于生物計(jì)數(shù)框中，采用視野法計(jì)數(shù)，并計(jì)算藻細(xì)胞密度. 比生長速率計(jì)算公式為[25]：

(1)

式中，C1和C2分別代表時(shí)間t1和t2時(shí)的細(xì)胞密度(cells/L).

2)鐵載體的測定 參考Schwyn等[27-28]的測定方法，藻液離心后取上清液(s)1 mL，加入1 mL CAS分析溶液和20 μL 0.2 mol/L 5-磺基水楊酸，搖勻，以不含鐵的BG11培養(yǎng)基作對照(r). 將樣品(s)和對照(r)與CAS的混合液在室溫下避光放置1 h后，于630 nm處測定吸光值(A). 鐵載體產(chǎn)量的計(jì)算公式為：

鐵載體產(chǎn)量=(Ar-As)/Ar

(2)

鐵載體產(chǎn)量低于0.01時(shí)被認(rèn)為是無鐵載體產(chǎn)生[29]，以單位濃度Chl.a的鐵載體產(chǎn)量用于數(shù)據(jù)分析.

3)堿性磷酸酶活性的測定 堿性磷酸酶活性測定方法為分光光度比色法[26]. 參考堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)的步驟，采用酶標(biāo)儀于405 nm處測定對硝基苯酚的吸光值，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)每微克葉綠素a產(chǎn)生的對硝基苯酚的量，以此表示細(xì)胞堿性磷酸酶活性(μmol/(μg Chl.a)·min).

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

水庫中擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對生物量與環(huán)境因子的關(guān)系，采用多元逐步回歸方法分析各因子對生物量和相對生物量變化的解釋量及回歸關(guān)系.

采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，比較相同磷源條件下3個(gè)鐵濃度實(shí)驗(yàn)組的Chl.a濃度、藻細(xì)胞密度以及比生長速率的差異；采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，分析磷源、鐵濃度以及兩者交互作用對比生長速率、堿性磷酸酶活性和鐵載體產(chǎn)量的影響. 顯著性水平均設(shè)定為P<0.05.

2 結(jié)果

2.1 水庫中擬柱孢藻和角星鼓藻的季節(jié)動(dòng)態(tài)

2.1.1 生物量和相對生物量的季節(jié)動(dòng)態(tài) 調(diào)查期間，擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對生物量均有明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài). 擬柱孢藻的生物量最大值為5.9 mg/L，相對生物量最大值為70%，出現(xiàn)在2017年的8月；角星鼓藻生物量最大值為2.6 mg/L，相對生物量最大值為66%，出現(xiàn)在2016年8月. 2016年8-10月期間，發(fā)生擬柱孢藻取代角星鼓藻的演替現(xiàn)象：擬柱孢藻的相對生物量由8月份的10%上升至9月份的35%，同時(shí)角星鼓藻的相對生物量由8月的66%逐漸下降至11月的0.5%. 2017年3-8月期間，擬柱孢藻的生物量和相對生物量逐漸上升，到8月份生物量達(dá)到5.9 mg/L，相對生物量達(dá)到70%，成為浮游植物群落中的絕對優(yōu)勢種類；角星鼓藻生物量在7-8月期間明顯升高，8月份生物量達(dá)到1.1 mg/L，相對生物量達(dá)到12.4%，與擬柱孢藻共同占浮游植物總生物量的82%.

圖2 擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對生物量的季節(jié)動(dòng)態(tài)Fig.2 Seasonal dynamics of biomass and relative biomass of C. raciborskii and Staurastrum spp.

2.1.2 生物量和相對生物量與環(huán)境因子的回歸關(guān)系 調(diào)查期間，水體溫度在17～32℃之間，pH值在7.6～9.1之間，透明度在0.8～1.4 m之間；TP濃度在0.021～0.047 mg/L之間，TN濃度在0.72～1.7 mg/L之間，TN∶TP質(zhì)量比在25～72之間；溶解性無機(jī)氮(DIN)濃度在0.18～0.92 mg/L之間，正磷酸鹽濃度在0.004 mg/L以下；總鐵濃度在0.067～0.26 mg/L之間，溶解性鐵濃度在0.049 mg/L以下.

多元逐步回歸分析表明，擬柱孢藻和角星鼓藻生物量均與水溫、pH值和SD沒有顯著的線性回歸關(guān)系；3種營養(yǎng)元素(N、P、Fe)中，只有溶解性氮和溶解性鐵對擬柱孢藻的生物量和相對生物量變化有顯著的解釋性作用(P<0.001)，擬柱孢藻的生物量與2個(gè)因子存在顯著的線性回歸關(guān)系(P<0.001)；角星鼓藻的生物量只與溶解性氮有顯著的線性回歸關(guān)系(P<0.001，表1).

表1 擬柱孢藻和角星鼓藻生物量的多元逐步回歸分析

*P<0.05，**P<0.01.

2.2 擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的生長比較

2.2.1 生長曲線 擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的Chl.a濃度和細(xì)胞密度均呈增長趨勢(圖3). 無機(jī)磷源條件下，擬柱孢藻N8的Chl.a濃度和細(xì)胞密度均隨鐵濃度降低而顯著降低(One-way ANOVA,P<0.05). 有機(jī)磷條件下，OPLFe組擬柱孢藻N8的Chl.a濃度和細(xì)胞密度顯著低于OPHFe組和OPMFe組(One-way ANOVA,P< 0.05)，但OPHFe組和OPMFe組之間沒有顯著差異. 培養(yǎng)期間，角星鼓藻FACHB-1449的Chl.a濃度差異和藻細(xì)胞密度差異均不顯著(One-way ANOVA,P>0.05).

圖3 擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的生長曲線 (擬柱孢藻N8的Chl.a濃度(a)和細(xì)胞密度(b)；角星鼓藻FACHB-1449的Chl.a濃度(c)和細(xì)胞密度(d))Fig.3 The growth curve for the Chl.a concentration and cell density of C. raciborskii N8 (a and b) and Staurastrum sp. FACHB-1449(c and d)

2.2.2 比生長速率 無機(jī)磷條件下，IPHFe、IPMFe和IPLFe實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的比生長速率分別為0.098±0.01、0.075±0.004、0.04±0.007 d-1，比生長速率隨鐵濃度的降低而顯著降低(One-way ANOVA，P<0.05；圖2). 有機(jī)磷源條件下，OPHFe、OPMFe和OPLFe實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的比生長速率分別為0.071±0.005、0.056±0.014和0.025±0.004 d-1，比生長速率隨鐵濃度降低而顯著降低(One-way ANOVA，P<0.05；圖4). 雙因素方差分析結(jié)果表明，磷源和鐵濃度對擬柱孢藻N8的比生長速率均有顯著作用(Two-way ANOVA,P<0.05；圖4)，但交互作用不顯著.

與擬柱孢藻N8組間有明顯差異不同，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中角星鼓藻FACHB-1449的比生長速率約為0.079±0.001 d-1，各組之間無顯著差異(Two-way ANOVA，P>0.05；圖4).

2.2.3 鐵載體產(chǎn)量 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組的角星鼓藻FACHB-1449均未檢出鐵載體，而擬柱孢藻N8均檢出較高的鐵載體產(chǎn)量. 無機(jī)磷源下，IPLFe、IPMFe和IPHFe組擬柱孢藻N8的鐵載體產(chǎn)量均值分別為0.0041、0.0037、0.0028，組間差異不顯著. 有機(jī)磷源下，各實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的鐵載體產(chǎn)量顯著高于無機(jī)磷條件各實(shí)驗(yàn)組，OPLFe組擬柱孢藻N8的鐵載體產(chǎn)量均值明顯高于OPMFe組和OPHFe組. 雙因素方差分析表明，磷源對擬柱孢藻N8鐵載體產(chǎn)量具有顯著影響，有機(jī)磷源條件下的鐵載體產(chǎn)量顯著高于無機(jī)磷源條件. 鐵濃度及其與磷源的交互作用對擬柱孢藻N8鐵載體產(chǎn)量的影響不顯著(Two-way ANOVA，P>0.05；圖5).

圖4 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻N8和角星鼓藻 FACHB-1449的比生長速率Fig.4 The specific growth rate of C. raciborskii N8 and Staurastrum sp. FACHB-1449 in six treatments

圖5 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻 N8鐵載體產(chǎn)量Fig.5 The siderophore production of C. raciborskii N8 in six treatments

2.2.4 堿性磷酸酶活性 所有實(shí)驗(yàn)組角星鼓藻FACHB-1449的堿性磷酸酶活性均較低，且無顯著差異(圖6). 擬柱孢藻N8的堿性磷酸酶活性顯著高于角星鼓藻FACHB-1449(One-way ANOVA，P<0.05). 雙因素方差分析表明，磷源和鐵濃度對擬柱孢藻N8酶活性均有顯著影響. 無機(jī)磷組的酶活性顯著低于有機(jī)磷組(P<0.05). 無機(jī)磷條件下，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的酶活性均呈下降趨勢，其中IPHFe組下降幅度最大，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢贗PHFe組酶活性接近0，顯著低于IPMFe組和IPLFe組(One-way ANOVA，P<0.05)；IPLFe組的酶活性下降速度和幅度均最低(圖6). 有機(jī)磷條件下，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8的酶活性一直維持在0.05～0.075 μmol/((μg Chl.a)·min)之間，在實(shí)驗(yàn)后期OPHFe組的酶活性顯著高于OPMFe組和OPLFe組(One-way ANOVA，P<0.05). 磷源和鐵濃度的交互作用對擬柱孢藻N8堿性磷酸酶活性的影響不顯著.

圖6 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻N8和角星鼓藻FACHB-1449的堿性磷酸酶活性Fig.6 The alkaline phosphatase activity of C. raciborskii N8 and Staurastrum sp. FACHB-1449 in six treatments

3 討論

3.1 鐵對擬柱孢藻和角星鼓藻季節(jié)動(dòng)態(tài)的作用比較

調(diào)查期間，擬柱孢藻和角星鼓藻生物量最高占到浮游植物總生物量的82%，是浮游植物群落中最重要的類群. 2種浮游植物的季節(jié)動(dòng)態(tài)有明顯的不同，表明其種群對環(huán)境條件變化的響應(yīng)存在差異. 環(huán)境因子數(shù)據(jù)表明，調(diào)查期間水體TN:TP質(zhì)量比在25以上，溶解性磷濃度一直在0.004 mg/L以下，該磷濃度條件對大多數(shù)浮游植物生長都有限制作用[30]. 擬柱孢藻和角星鼓藻是典型適應(yīng)低磷環(huán)境的種類[5,30]，該生理特征可能是2種浮游植物能夠在大沙河水庫成為優(yōu)勢種的重要原因. 統(tǒng)計(jì)分析表明溶解性磷濃度對擬柱孢藻和角星鼓藻生物量和相對生物量的季節(jié)變化沒有顯著的解釋性作用，在長期低無機(jī)磷濃度條件下，2種浮游植物的季節(jié)動(dòng)態(tài)主要由溶解性氮和溶解性鐵濃度變化解釋. 擬柱孢藻和角星鼓藻生物量均與溶解性氮濃度呈顯著的負(fù)線性回歸關(guān)系，但只有擬柱孢藻生物量與溶解性鐵濃度有顯著的線性回歸關(guān)系. 該結(jié)果表明，2種浮游植物生物量對環(huán)境因子的響應(yīng)主要體現(xiàn)在對溶解性鐵濃度的響應(yīng)差異上；鐵對擬柱孢藻的季節(jié)動(dòng)態(tài)有重要作用，溶解性鐵濃度的減少是導(dǎo)致擬柱孢藻競爭優(yōu)勢降低的重要原因.

3.2 鐵對擬柱孢藻和角星鼓藻生長的作用比較

3.2.1 無機(jī)磷源條件下鐵濃度對2種藻生長影響的差異 以細(xì)胞密度和Chl.a濃度表示生長曲線，兩者趨勢基本一致. 無機(jī)磷條件下，擬柱孢藻N8的比生長速率均隨鐵濃度的降低而顯著降低，而各實(shí)驗(yàn)組角星鼓藻FACHB-1449比生長速率沒有明顯差異(圖4). 當(dāng)一定的資源濃度條件下細(xì)胞生長速率小于最大生長速率，且該資源濃度小于最大生長速率對應(yīng)的資源濃度時(shí)，藻細(xì)胞的生長受到限制，比生長速率隨該資源濃度的上升而增加[31]. 0.029 mg/L和0.29 mg/L鐵濃度條件下擬柱孢藻生長受到限制作用，但角星鼓藻的生長限制作用不明顯. 該結(jié)果表明，與擬柱孢藻N8相比，角星鼓藻FACHB-1449能在更低的Fe3+濃度條件下正常生長.

為進(jìn)一步明確鐵的限制作用的種間差異，我們對鐵載體產(chǎn)量進(jìn)行了比較. 擬柱孢藻N8各組均檢出較高的鐵載體產(chǎn)量，且各組的鐵載體組內(nèi)方差較大，而角星鼓藻FACHB-1449各實(shí)驗(yàn)組均未檢出鐵載體(圖5). 鐵載體是藻細(xì)胞在鐵限制條件下產(chǎn)生的有機(jī)小分子物質(zhì)，為八面體結(jié)構(gòu)的異羥肟酸型和鄰苯二酚型小分子物質(zhì)，對Fe3+具有較強(qiáng)的鰲合作用，同時(shí)鐵離子—鐵載體復(fù)合物能被細(xì)胞外膜上的鐵受體蛋白特異性識別并將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)從而緩解鐵限制[16,32]. 已有研究提出，藍(lán)藻細(xì)胞能直接利用Fe2+，而對Fe3+的吸收主要通過鐵載體途徑完成[33]，鐵載體產(chǎn)量指示細(xì)胞生長受到鐵限制及環(huán)境Fe2+供應(yīng)不足. 本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基鐵源為Fe3+，通過鐵載體獲取鐵可能是擬柱孢藻利用鐵的主要途徑，這可能是高鐵實(shí)驗(yàn)組中擬柱孢藻N8也能檢出鐵載體產(chǎn)量的重要原因. 綠藻能通過多種途徑利用鐵元素. 除了能分泌鐵載體途徑利用鐵外[34-35]，綠藻還能直接吸收Fe3+[36]，或通過分泌還原酶(FCR)，將Fe3+螯合物還原成Fe2+和螯合物配體[35,37]. 本實(shí)驗(yàn)中所有角星鼓藻FACHB-1449實(shí)驗(yàn)組均未檢測到鐵載體，表明角星鼓藻可能不通過鐵載體途徑利用鐵.

此外，在無機(jī)磷源條件下，各實(shí)驗(yàn)組擬柱孢藻N8在實(shí)驗(yàn)初期均有檢到堿性磷酸酶活性，這與接種前進(jìn)行了磷饑餓處理有關(guān). 堿性磷酸酶為一類誘導(dǎo)酶，其產(chǎn)生受一系列生理過程調(diào)控. 酶活性對胞外磷濃度的響應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)滯后現(xiàn)象[38-39]. 隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，高鐵組的酶活性逐漸降低，但中鐵組和低鐵組酶活性降低緩慢(圖6). 低鐵組胞外無機(jī)磷濃度并不限制其生長，但較低的鐵濃度可能不利于細(xì)胞對磷的吸收.

3.2.2 有機(jī)磷源條件下鐵對2種藻生長影響的差異 有機(jī)磷條件下，所有實(shí)驗(yàn)組的擬柱孢藻N8比生長速率都低于無機(jī)磷高鐵組，且隨鐵濃度降低而降低(圖4). 此外，有機(jī)磷條件下的鐵載體產(chǎn)量和堿性磷酸酶活性均顯著高于無機(jī)磷條件(圖5和圖6). 上述結(jié)果表明，有機(jī)磷條件下細(xì)胞生長同時(shí)受磷和鐵的限制. 與擬柱孢藻N8不同，角星鼓藻FACHB-1449各實(shí)驗(yàn)組的比生長速率與無機(jī)磷高鐵組的差異不顯著，且無鐵載體產(chǎn)生，堿性磷酸酶活性也較低，3個(gè)指標(biāo)均表明磷源和鐵濃度對角星鼓藻FACHB-1449的生長沒有明顯限制作用.

溶解性無機(jī)磷缺乏時(shí)，細(xì)胞通過產(chǎn)生堿性磷酸酶水解和利用有機(jī)磷，滿足藻細(xì)胞的磷需求[40-41]. 堿性磷酸酶是一類蛋白酶，其合成需要氮的參與，鐵是氮還原酶的組成部分，決定氮同化速率及酶的合成[42]. 此外，F(xiàn)e3+是PhoX型堿性磷酸酶活性中心的關(guān)鍵組成部分[43]. 鐵參與堿性磷酸酶的產(chǎn)生和有機(jī)磷利用過程中的多個(gè)環(huán)節(jié). 有機(jī)磷條件下，擬柱孢藻N8鐵載體產(chǎn)量顯著高于無機(jī)磷條件. 表明有機(jī)磷條件下細(xì)胞對鐵的需求高于無機(jī)磷條件. 低鐵組鐵載體明顯高于其他組，但由于各實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)方差較大，不能通過鐵載體產(chǎn)量識別藻細(xì)胞鐵限制程度的組間差異.

大部分浮游植物能夠產(chǎn)生堿性磷酸酶，但堿性磷酸酶的產(chǎn)生以及對有機(jī)磷的利用能力存在明顯的種間差異[44-45]. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，2種藻均能在有機(jī)磷環(huán)境生長，但堿性磷酸酶活性存在顯著差異. 所有角星鼓藻FACHB-1449實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶活性一直維持在較低的水平，且不受鐵濃度變化的影響. 擬柱孢藻N8的堿性磷酸酶活性遠(yuǎn)高于角星鼓藻FACHB-1449，且高鐵組酶活性顯著高于低鐵組(圖6). 我國熱帶水庫的溶解性無機(jī)磷濃度普遍較低，水體磷主要以有機(jī)磷形式存在. 角星鼓藻和擬柱孢藻均能適應(yīng)這種低無機(jī)磷環(huán)境[3,46]，本實(shí)驗(yàn)也支持該結(jié)論. 在這類溶解性無機(jī)磷濃度偏低的水體中，鐵濃度的降低可能限制擬柱孢藻的生長，而角星鼓藻維持正常生長. 野外調(diào)查結(jié)果顯示，在熱帶水庫分層強(qiáng)烈的季節(jié)，湖上層常出現(xiàn)高pH值和富氧條件，不利于溶解性鐵尤其是Fe2+的存在，此時(shí)的水環(huán)境即為低無機(jī)磷和低鐵環(huán)境[20]. 角星鼓藻常在該地區(qū)水庫處于水體強(qiáng)分層時(shí)成為優(yōu)勢種，而擬柱孢藻在該時(shí)期的生物量較低. 擬柱孢藻和角星鼓藻的演替現(xiàn)象常出現(xiàn)在這類水體[47]，這可能與2種藻的限制性鐵濃度差異有關(guān).

4 結(jié)論

在溶解性無機(jī)磷長期偏低的大沙河水庫中，擬柱孢藻和角星鼓藻是浮游植物群落的主要優(yōu)勢種類，2種浮游植物生物量具有明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài)，其生物量對環(huán)境因子的響應(yīng)的區(qū)別主要體現(xiàn)在對溶解性鐵濃度的響應(yīng)差異上. 與角星鼓藻相比，擬柱孢藻更易受到鐵的限制，有機(jī)磷源條件擬柱孢藻的鐵需求明顯高于無機(jī)磷條件，有機(jī)磷源條件會(huì)增強(qiáng)鐵對擬柱孢藻生長的限制作用.