雷艷娟 夏占峰 曾 紅 張利莉

（塔里木大學生命科學學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

植物內生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段存活于健康植物組織內部或細胞間隙，而不使宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物，包括細菌、真菌和放線菌［1］。受溫度、濕度、土壤情況等生長環(huán)境因素的影響，即便同種植物也會因地理位置的不同，表現出內生菌多樣性分布的差異。云南大學微生物研究所陳華紅等［2］從云南不同地點采集藥用植物分離內生放線菌，其種類、數量有很大差異，表明了宿主的地域多樣性在一定程度上決定了內生放線菌的多樣性。來自植物內生菌的化合物約51%是新化合物［3］，而來自土壤微生物的只有38%是新化合物，因此植物內生菌的研究備受關注。不同地域和種類的植物提供了內生菌生境的多樣性，拓寬了篩選活性物質的途徑。目前，在真菌、細菌、放線菌等植物內生菌中，因放線菌生長緩慢、分離困難而研究相對較少。植物內生放線菌研究也主要集中于藥用植物、雨林植物等陸地植物和紅樹林等海洋植物，荒漠植物內生放線菌是尚未充分開發(fā)的新領域，值得探索研究。

塔里木盆地處于天山、昆侖山和阿爾金山之間，邊緣是與山地相連的礫石戈壁，中心是塔克拉瑪干沙漠，受地形氣候影響，盆地邊緣和沙漠之間的土壤干旱、鹽漬化嚴重；孕育了很多具有防風固沙作用的荒漠鹽生植物，如鹽生灌木檉柳、鹽穗木、駱駝刺等，它們適應干旱高鹽生境，具有較強的耐旱抗鹽能力［4］。干旱生境下的微生物為了能在持續(xù)缺水和高鹽等嚴酷條件下生長，就不得不在生理和分子方面進化［5］，在這樣極端環(huán)境下生長的植物，其內生放線菌，伴隨宿主植物長期適應性協同進化，除了產生新的基因型，還可能產生新型次級代謝產物［6］。感染性疾病是目前臨床上最常見的疾病，在人類疾病方面，金黃色葡萄球菌所致的皮膚軟組織感染，大腸桿菌所致的泌尿生殖道感染及白色念珠菌所致的念珠菌性陰道炎較常見；此外，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對家畜、家禽及其他經濟動物也是易感染的，如奶牛乳房炎和肉雞大腸桿菌病［7-9］。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌這三種病原菌分別作為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌的模式菌株研究具有代表意義。在植物病害方面，棉花枯萎病和黃萎病以及紅棗黑斑病已成為新疆兩大經濟作物的最大病害。黃萎病導致棉花經濟損失15%以上，紅棗黑斑病嚴重時減產50%［10-11］，因此迫切需要尋找能夠抵抗人類或植物病害的新型活性天然產物。為了更好保護和利用塔里木盆地微生物資源，本研究以13種荒漠植物為材料，分離其內生放線菌，探索新疆典型荒漠植物內生放線菌的群落結構；以人體病原菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌，紅棗黑斑病致病菌細極鏈格孢菌、棉花黃萎病致病菌大麗輪枝菌、棉花枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌為靶標菌，篩選活性菌株，以期尋找新型抗菌活性化合物的生產菌株，為生物醫(yī)藥和生物肥料提供菌株來源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2018年7月至8月在新疆天山山脈戈壁和鹽堿地采集檉柳（Tamarix chinensisLour.）、堿蓬（Suaeda glauca（Bunge）Bunge）、河西菊（Launaea polydichotoma（Ostenf.）Amin ex N.Kilian）、鹽穗木（Halostachys caspica（Bieb.）C.A.Mey.）、鹽爪爪（Kalidium foliatum（Pall.） Moq.）、鹽 節(jié) 木（Halocnemum strobilaceum（Pall.）M.Bieb.）、鹽生草（Halogeton glomeratus（M.Bieb.）Ledeb.）、鈴鐺刺（Halimodendron halodendron（Pall.）Voss）、駱駝刺（Alhagi sparsifoliaShap.）、耳葉補血草（Limonium otolepis（Schrenk）Ktze.）、老鸛草（Geranium wilfordiiMaxim.）、西伯利亞鐵線蓮（Clematis sibirica（L.）Mill.）和新疆豬毛菜（Salsola sinkiangensisA.J.Li）13種植物樣品，樣品裝于自封袋中，帶回實驗室，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試靶標菌

以革蘭陽性細菌代表種金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,S.a）敏感株 ATCC 25923、革蘭陰性細菌代表種大腸桿菌（Escherichia coli,E.c）敏感株ATCC 25922、酵母菌代表種白色念珠菌（Candida albicans,C.a）ATCC 64550以及植物病原菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae,V.d）ACCC 36916、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum,F.o）ACCC 372587和細極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima,A.t）為靶標菌進行活性放線菌的篩選。

1.3 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基：SCA培養(yǎng)基。

（2）純化及斜面培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基。

（3）活性篩選培養(yǎng)基：革蘭陽性細菌和革蘭陰性細菌培養(yǎng)選用美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）中的MHA（MHB）培養(yǎng)基培養(yǎng)。白色念珠菌選用SDA（SDB）培養(yǎng)基培養(yǎng)；大麗輪枝菌、尖孢鐮刀菌選用PDA（PDB）培養(yǎng)基培養(yǎng)；細極鏈格孢菌選用OA（OB）培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 化學試劑

（1）抑制劑：重鉻酸鉀、萘啶酮酸、放線菌酮、制霉菌素終濃度均為50 mg/L，待培養(yǎng)基溫度降至40～50℃時加入。

（2）PBS緩沖液（g/L）：NaCl 8.0，KCl 0.2，Na2HPO41.4，KH2PO40.27。

1.5 植物內生菌的分離、保藏和鑒定

參考李飛娜等［12］實驗方法，將植物根進行表面消毒、研磨，磨碎的植物組織用PBS緩沖液混勻，涂布于SCA培養(yǎng)基，每種樣品設置三組平行實驗。最后一次清洗樣品的無菌水取100 μL涂布于SCA培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)1周，檢測植物表面消毒效果。沒有微生物生長，說明植物表面消毒徹底，分離到的放線菌為植物內生放線菌。對放線菌采用三區(qū)劃線法進行純化，直至得到純菌株。以20%（體積比）甘油作為保護劑，將菌株接種于其中，置于-80℃保藏。

采用酶解法提取放線菌基因組DNA，擴增16S rRNA基因序列，送往北京睿博興科測序公司測序。登錄數據庫EzBioCloud［13］（http://www.ezbiocloud.net），對16S rRNA基因序列進行相似性比對，從中選取相似性較高的典型菌株16S rRNA基因序列作為參比對象，采用MEGA 7.0軟件以鄰接法（neighbor-joining）進行聚類分析，并構建系統(tǒng)進化樹［14］，根據序列比對結果和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株的種類。

1.6 抗菌活性篩選

將待檢測的放線菌菌株接種于高氏固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7天，制為直徑7 mm的菌餅備用。對于細菌，采用瓊脂擴散法，將靶標菌單菌落接種至10 mL MHB培養(yǎng)基，37℃，180 rpm搖床培養(yǎng)8 h，取100 μL涂布于MHA培養(yǎng)基，接種放線菌菌餅，置于培養(yǎng)箱中孵育18 h。對于真菌，靶標菌為白色念珠菌時，拮抗活性的檢測方法與細菌相同，只需將培養(yǎng)基換為SDA；靶標菌為大麗輪枝菌、尖孢鐮刀菌時，采用平板對峙法稍做修改，將PDA培養(yǎng)基上靶標菌接種至10 mL PDB培養(yǎng)基，20℃，180 rpm搖床培養(yǎng)72 h，取100 μL涂布于PDA培養(yǎng)基，接種放線菌菌餅，置于20℃培養(yǎng)箱中孵育48 h；靶標菌為細極鏈格孢菌時，將OA培養(yǎng)基上細極鏈格孢菌的孢子，用無菌棉簽收集至無菌水中，取100 μL涂布于OA培養(yǎng)基，接種放線菌菌餅，置于28℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。各設置平行實驗3組，計算抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 13種荒漠植物根內生放線菌多樣性分析

通過SCA分離培養(yǎng)基從13種植物根分離出533株放線菌，根據菌落特征初步排除重復后，選取361株提取基因組DNA，進行16S rRNA基因序列擴增和測序，通過EZbiocloud進行比對分析。結果顯示，361株內生放線菌，分屬于放線菌綱的6個目7個科9個屬77個種，這9個屬分別是鏈霉菌屬（Streptomyces）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）、擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、冢村氏菌屬（Tsukamurella）、糖霉菌屬（Glycomyces）、鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）、倫茨菌屬（Lentzea）、北里孢菌屬（Kitasatospora）。

13種荒漠植物根內生放線菌群落結構結果見表1。由表1可以看出，不同荒漠植物內生放線菌多樣性有差異。從分離到的菌株數量上看差異較大，老鸛草最多，依次為駱駝刺、鈴鐺刺、紅柳、補血草、堿蓬、鐵線蓮、鹽爪爪、河西菊、豬毛菜、鹽節(jié)木、鹽生草和鹽穗木。從種屬水平看差異也較大，駱駝刺內生放線菌最豐富，鑒定到6個屬27個種，鏈霉菌屬有20個種（圖1）；堿蓬次之，鑒定到4個屬9個種，鏈霉菌屬有6個種；S.griseoincarnatus為駱駝刺和堿蓬內生放線菌中分離頻率最高的優(yōu)勢種；檉柳鑒定到3個屬17個種，鏈霉菌屬有15個種，S.plicatus為優(yōu)勢種；老鸛草分離到的菌株數量最多，歸屬于3個屬，S.pactum為優(yōu)勢種；鈴鐺刺鑒定到2個屬，其中的鏈霉菌屬有28個種，S.ambofaciens優(yōu)勢種；豬毛菜、鹽穗木等鑒定到鏈霉菌屬。此外，16S rRNA基因序列比對結果顯示，361株內生放線菌中有3株相似性小于98.65%，為潛在新種，與3個已有效發(fā)表的放線菌物種相似性最高，見表2。在駱駝刺、檉柳和鹽爪爪各1株，均屬于鏈霉菌的潛在新物種，具體分類地位正在進行多相分類學研究確認。

由表1和表3可以看出，本研究荒漠植物內生放線菌中，鏈霉菌為優(yōu)勢屬，在13種植物中均有分布。此外，獲得8個稀有放線菌屬，擬諾卡氏菌屬在8種植物中有分布，擬無枝酸菌屬在5種植物中有分布，諾卡氏菌屬在3種植物中有分布，糖霉菌屬、鏈孢囊菌屬和倫茨菌屬僅在駱駝刺中分離得到，而北里孢菌屬僅在老鸛草分離到，冢村氏菌屬也僅在鹽生草中分離到。表明放線菌的鏈霉菌可在植物中廣泛分布，擬諾卡氏菌屬、擬無枝酸菌屬可能在植物中選擇性分布，還有一些放線菌對宿主植物選擇具有特異性。擬諾卡氏菌屬是稀有放線菌中產新型天然活性化合物最多的，擬無枝酸菌屬僅次于小單孢菌屬位列第三［15］，這類型菌株產生的化合物具有廣泛的生物學活性，在醫(yī)藥方面作為抗菌、抗過敏、抗腫瘤、降血脂、抗腫瘤等藥物有很好的療效。本研究中，分離得到的擬諾卡氏菌屬和擬無枝酸菌屬，為后續(xù)抗菌活性物質的篩選提供了更大的可能性。經文獻調研，冢村氏菌屬與倫茨菌屬為首次從植物中分離到。

2.2 荒漠植物內生放線菌抗菌活性篩選

361株荒漠植物根內生放線菌的抗菌活性篩選結果見表4。結果顯示有80株活性放線菌，占鑒定總數的22%，其中鏈霉菌74株，擬無枝酸菌3株，擬諾卡氏菌、糖霉菌和鏈孢囊菌各1株。

鈴鐺刺內生放線菌中，僅鏈霉菌屬有活性菌株15株；駱駝刺內生放線菌中，活性菌株共有12株，鏈霉菌有9株；擬諾卡氏菌屬、糖霉菌屬、鏈孢囊菌屬中的活性菌株各為一株，鏈孢囊菌和糖霉菌為稀有放線菌中少見的有抑菌活性的菌株，鏈孢囊菌Streptosporangiumamethystogenessubsp.amethystogenes（TRM 64968）對白色念珠菌有抑制作用，糖霉菌Glycomyces algeriensis（TRM 65112）對大腸桿菌和白色念珠菌有抑制；擬諾卡氏菌屬中Nocardiopsis dassonvilleisubsp.dassonvillei（TRM 64374）對大麗輪枝菌有抑制。駱駝刺中，TRM 64368、TRM 64461、TRM 65026三株放線菌均與S.griseoincarnatus的16S rRNA基因序列相似性為100%，抗菌譜卻不同；此外，堿蓬中TRM 64934和TRM 64935也與S.griseoincarnatus16S rRNA基因序列相似性為100%，不僅抗菌譜不同，抗菌強度也不一樣，見表5。

圖1 基于駱駝刺根內生放線菌16S rRNA基因序列構建的neighbour-joining系統(tǒng)進化樹

表2 13種荒漠植物根內生放線菌中的潛在新物種

表3 361株內生放線菌的多樣性

對于不同靶標病原菌，拮抗大腸桿菌的活性放線菌有39株，拮抗鏈格孢菌的活性放線菌有35株，拮抗金黃色葡萄球菌的活性放線菌有31株，拮抗白色念珠菌的活性放線菌有30株，拮抗尖孢鐮刀菌的活性放線菌有17株，拮抗大麗輪枝菌的活性放線菌有6株。鈴鐺刺內生放線菌S.rectiviolaceus（TRM 64937）對大腸桿菌、尖孢鐮刀菌、白色念珠菌和細極鏈格孢菌均有抑制作用，該菌株是13種植物中對尖孢鐮刀菌抑制作用最強的菌株，抑菌圈直徑為 15 mm；S.albidoflavus（TRM 64433）對白色念珠菌抑制作用最強，抑菌圈直徑為16 mm。駱駝刺內生放線菌中S.variabilis（TRM 64369）對鏈格孢菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑達到30 mm；S.griseoincarnatus（TRM 65060）對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，抑菌圈直徑達到21 mm。補血草內生放線菌S.bangladeshensis（TRM 64784）對大麗輪枝菌抑菌活性最強，抑菌圈直徑25 mm。河西菊內生放線菌S.anulatus（TRM 64326）對大腸桿菌抑菌活性最強，抑菌圈直徑23 mm。

對3種病原菌均有抑菌作用的有S.rectiviolaceus（TRM 64937）、S.rochei（TRM 64439）、S.pactum（TRM 64989）、S.griseoincarnatus（TRM 65060）、S.griseorubens（TRM 64343），后三者是13種植物內生放線菌中鏈霉菌屬分離頻率最高的物種，S.griseoincarnatus和S.griseorubens在13種荒漠植物中的檉柳、豬毛菜、補血草、堿蓬、駱駝刺都有分布。自河西菊中篩選出的放線菌活性菌株比率最高（河西菊活性菌株數量/河西菊分離菌株數量），結合抑菌活性強度、活性菌株的數量與多樣性，駱駝刺和河西菊是13種荒漠植物內生放線菌中適合抗菌活性篩選的植物。

表5 對不同病原菌有較強活性的菌株

續(xù)表5 對不同病原菌有較強活性的菌株

3 結論與討論

近年來，隨著臨床耐藥菌和植物真菌病害的發(fā)展，熱帶雨林植物、藥用植物、紅樹林植物及經濟作物內生放線菌的研究與日俱增，荒漠植物內生放線菌鮮有研究。因此，本實驗選用13種荒漠植物為材料，分析其內生放線菌的多樣性，研究荒漠植物內生放線菌在抗菌方面的潛在應用價值。

13種荒漠植物共分離出533株內生放線菌，去除重復后對361株進行16S rRNA基因序列測定，結果顯示共有9個屬。研究表明類似土壤環(huán)境，鏈霉菌在植物樣品中也廣泛分布［16］，是植物體內優(yōu)勢放線菌，本研究鏈霉菌也是優(yōu)勢屬，占鑒定菌株總數的88%，在13種樣品根部均有分布。這些植物樣品中內生放線菌多樣性最豐富的是駱駝刺，由6個屬組成：鏈霉菌屬（Streptomyces）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、倫茨菌屬（Lentzea）、糖霉菌屬（Glycomyces）、鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）。張曉波［17］等人，采集新疆北疆克拉瑪依戈壁荒漠的駱駝刺進行內生細菌分離鑒定時，分離出放線菌門中的棒桿菌屬（Corynebacterium）、考克氏菌屬（Kocuria）、細桿菌屬（Microbacterium）和微球菌屬（Micrococcus）。同為駱駝刺樣品，但多樣性差異很大，主要原因可能是地理位置不同，南疆和北疆的氣候差異明顯。南疆被山脈環(huán)繞，受不到大氣環(huán)流影響，降水量極少，不僅干旱，受緯度和沙漠影響輻射也更強，相同樣品的內生放線菌群落結構組成會不同。這與前期學者研究結果一致：不同地區(qū)的同種植株內生放線菌，在數量與種類上分布有差異的規(guī)律［2］。

稀有放線菌是鏈霉菌以外其他放線菌的統(tǒng)稱，擬諾卡氏菌屬是本研究中植物內生稀有放線菌中優(yōu)勢屬，這與祁鶴興和祖麗皮亞木·木沙爾［6,18］等人研究結果相似。本研究值得注意的是，除擬諾卡氏菌屬外，擬無枝酸菌屬也是13種荒漠植物內生稀有放線菌中的優(yōu)勢屬，這可能與植物所處的干旱鹽堿生境有關，有研究表明擬無枝酸菌通常存在于干旱環(huán)境［19-20］，擬諾卡氏菌屬的分離也大多對鹽分需求較高［21-22］。新疆為“三山夾兩盆”地形，降水稀少，水源主要為山區(qū)的大小河流，這些河流溶解了古生代海相巖層中的鹽分，流入盆地［23］，在蒸發(fā)大、極端干旱氣候條件下，將鹽分積累在土壤中。為適應鹽漬化土壤，植被多為泌鹽鹽生植物如胡楊、檉柳和莖葉肉質化的鹽生植物如鹽節(jié)木、新疆豬毛菜，這些鹽生植物體內含有大量可溶性鹽，為擬諾卡氏菌屬和擬無枝酸菌屬提供了適宜的生境。除老鸛草外，其余12種植物均為能適應新疆干旱鹽漬生境的鹽生植物，新疆的地理氣候和植物生長的土壤類型可能與兩類稀有放線菌定殖相關。

從抗菌活性篩選結果看，篩選到80株活性放線菌，占比22%，是活性放線菌的主要類群，這與先前學者研究結果鏈霉菌是拮抗菌株的重要來源［16］相符。本實驗選用棉花枯黃萎病病原菌和紅棗黑斑病病原菌為靶標菌，嘗試運用當地微生物資源解決當地農作物生產過程中遇到的植物真菌感染。TRM 6478416S rRNA基因序列與S.bangladeshensis相似性100%，該菌對棉花黃萎病病原菌V.dahliae有很好的抑制作用，有研究表明S.bangladeshensis可產生真菌抑制劑鄰苯二甲酸雙-（2-乙基己基）酯（bis-（2-ethylhexyl）phthalate）［24］。TRM 6436916S rRNA基因序列與S.variabilis相似性99.57%，對紅棗黑斑病病原菌A.tenuissima有很強的抑制作用，這與 Gherbawy［25］研究結果類似，其結果發(fā)現S.variabilisYH21具有幾丁質酶活性，幾丁質酶有降解病原真菌細胞壁的功能。此外，S.variabilis還有產肝素酶的能力，能抗血栓，以及抑制臨床細菌生物膜的作用。說明TRM 64784和TRM 64369具有潛在的應用價值，尤其是在作為生物防治棉花黃萎病和紅棗黑斑病方面，可作為生防菌株進行進一步的研究。

對不同靶標菌的抑制，本研究中荒漠植物內生放線菌對大腸桿菌有抑制作用的菌株最多，細極鏈格孢菌次之。這與祖麗皮亞木·木沙爾［18］研究的新疆藥用植物百里香內生放線菌的抗菌活性結果有差異，他們的活性菌株中對植物病原真菌有活性的最多，對人類致病的革蘭陽性和陰性菌有活性的菌株最少。S.anulatus對植物病原真菌具有廣譜抑制性［26］，TRM 64326的16S rRNA基因序列與其相似性100%卻對大腸桿菌表現出很強的抑制作用，僅對供試的3種植物病原真菌中棉花枯萎病病原菌F.oxysporum有微弱抑制。說明菌株來源不同，對病原菌的抑制作用也會不同，荒漠植物內生放線菌的抗菌譜和抗菌強度也類似多樣性，表現出地域和植物種類的差異。此外，本研究中同一駱駝刺植株中TRM 64368、TRM 64461和TRM 65025三株鏈霉菌與S.griseoincarnatus16S rRNA基因序列相似性均是100%，但它們的抑菌活性差異很大，見表5。表示在抗菌活性篩選時，同一植株中與典型菌株為同一物種的菌株，活性也會不同；即同一物種的菌株活性有差異，在篩選時對每個菌株都進行檢測，可以盡可能避免遺漏活性菌株。

本次研究，活性放線菌菌株主要有鏈霉菌，其次是擬無枝酸菌。擬無枝酸菌屬是一類重要的抗生素產生菌，以產生用于臨床抗耐藥菌感染治療的萬古霉素和抗結核的利福霉素備受關注，廣泛應用于醫(yī)藥。近年來，陸續(xù)研究發(fā)現，擬無枝酸菌產生的新化合物占稀有放線菌產生的新天然產物11%［15］，表明擬無枝酸菌屬和擬諾卡氏菌屬一樣是尋找有用天然產物的重要來源。

從13種阿克蘇地區(qū)荒漠植物鑒定出361株內生放線菌，進行了多樣性和抗菌活性研究。荒漠植物內生放線菌豐富的物種多樣性，為放線菌資源貯備和后續(xù)深入開展活性次級代謝產物挖掘打下基礎，具有研究和潛在應用價值。