安江紅，張文靜，趙瑛琳，韓 冰，南金生

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011；2.內(nèi)蒙古科技信息網(wǎng)絡(luò)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

普通小麥（Triticum aestivum L.）、大麥（Hordeum vulgare L.）、燕麥（Avena sativa L.）和黑麥（Secale cereale L.），是世界上重要的糧食作物。小黑麥?zhǔn)堑?種人工雜交產(chǎn)生的新型作物，結(jié)合了小麥和黑麥種質(zhì)與籽粒產(chǎn)量的優(yōu)良特性，具有抗病和抗逆的優(yōu)勢。

籽粒硬度是指破壞籽粒時受到的阻力，即破壞籽粒需要的力[1]。籽粒硬度是國際較通用的商品小麥分類的重要指標(biāo)，是市場分級和定價的重要性狀之一，影響潤麥加水量、出粉率、破損淀粉數(shù)量和面粉顆粒度，決定磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)[2]。大麥?zhǔn)鞘澜缟现匾娘暳献魑锖推【乒I(yè)的原料，籽粒硬度影響大麥麥芽品質(zhì)，且籽粒顆粒大小還影響動物的消化和吸收[3]。燕麥?zhǔn)羌Z飼兼用作物，是世界性的栽培作物，分為裸粒型（裸燕麥）和帶稃型（皮燕麥）兩大類。籽粒硬度影響燕麥米的成米率、燕麥粉顆粒度和燕麥片的爽滑度等[4]。筆者就麥類作物籽粒硬度研究進(jìn)行了綜述，旨在更好地了解麥類作物籽粒硬度的研究現(xiàn)狀，從而為其遺傳改良和育種提供理論基礎(chǔ)。

1 籽粒硬度檢測方法

麥類作物中，小麥籽粒硬度檢測方法研究最為全面和深入。測定小麥籽粒硬度的傳統(tǒng)方法[5-8]、國標(biāo)方法[9]以及近年來發(fā)展的快速測定方法比較多[10-12]（表1），以力學(xué)方法最為經(jīng)典[13]。其中，近紅外光譜法（near infrared reflect，NIR）、單籽粒谷物特性測定儀法（single kernel characterization system，SKCS）與現(xiàn)行國標(biāo)方法硬度指數(shù)法（GB/T 21304—2007）之間有很好的一致性[14-16]。也有研究用其他方法檢測谷物籽粒硬度，例如針尖壓入法[17]、基于可見-近紅外光譜的徑向基函數(shù)（RBF）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型[18]、質(zhì)構(gòu)儀法等[4，19-20]。麥類作物的籽粒具有類似的物理結(jié)構(gòu)特點，但在檢測籽粒硬度時應(yīng)選擇適合的方法，否則無法表征其真實的硬度。例如小麥籽粒短圓，而燕麥籽粒普遍偏細(xì)長，單籽粒較小麥輕，在使用SKCS 法進(jìn)行檢測時由于無法均勻地使單一籽粒落入稱量斗，導(dǎo)致測量值不準(zhǔn)確，SKCS 法不適于燕麥籽粒硬度檢測。另外，燕麥具有高脂肪的特點，其脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)6%～8%，這一特點導(dǎo)致燕麥粉極易黏結(jié)成塊，無法順利通過篩網(wǎng)，影響硬度測量的準(zhǔn)確性，因此，基于碾磨的方法也不適用于燕麥籽粒硬度檢測[20]。質(zhì)構(gòu)儀法可以實現(xiàn)單籽粒的壓縮，不需要磨粉，適合沒有標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的作物籽粒硬度檢測。

2 籽粒硬度與籽粒成分的關(guān)系

麥類作物籽粒組分主要包括淀粉、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和膳食纖維等。籽粒胚乳質(zhì)地是籽粒化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果[21]，麥類作物籽粒的成分與籽粒硬度直接相關(guān)。

利用掃描電鏡觀察硬質(zhì)與軟質(zhì)小麥籽粒的斷面，發(fā)現(xiàn)軟質(zhì)小麥的淀粉近似球形，而硬質(zhì)小麥籽粒斷面破損淀粉顆粒較多，胚乳結(jié)構(gòu)相對致密[22]。籽粒中淀粉顆粒和蛋白質(zhì)基質(zhì)間的黏結(jié)力以及包被淀粉顆粒的蛋白質(zhì)基質(zhì)連續(xù)性共同決定了小麥籽粒硬度[23]。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白質(zhì)主要存在于水洗淀粉表面，大小約15 kDa，命名為Friabilin 蛋白，在軟質(zhì)小麥中的表達(dá)量高[24]，約為硬質(zhì)小麥的10倍。燕麥籽粒比小麥籽粒軟，在使用相近的力碾壓籽粒后，燕麥成片狀，而小麥成粉狀（圖1）。與小麥類似，軟質(zhì)燕麥的淀粉粒之間空隙較大，與蛋白呈分離狀態(tài)，而硬質(zhì)燕麥淀粉粒緊湊，與蛋白緊密相連，細(xì)胞壁空隙?。▓D2）[4]。另外，燕麥中脂質(zhì)含量豐富，通常與直鏈淀粉形成淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物[25-26]，而影響淀粉的生理特性，未脫脂燕麥淀粉的破損顆粒較多，脫脂后破損顆粒減少，顆粒也變得均勻[27]。燕麥脂質(zhì)可能參與淀粉和蛋白的結(jié)合，共同影響籽粒硬度。

小麥籽粒硬度是在籽粒脫水過程中形成的[28-29]。小麥的硬度指數(shù)與籽粒中水分的變化在一定范圍內(nèi)正相關(guān)[30]，12%～13%的水分含量是小麥抗粉碎硬度指數(shù)最佳靈敏范圍[31]。燕麥與小麥類似，籽粒水分含量在10.62%～11.84%時，硬度上升最顯著[4]。β-葡聚糖、阿拉伯基木聚糖是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)多糖，在胚乳細(xì)胞壁相互連接，增大了細(xì)胞壁的支撐性，大麥籽粒中的非淀粉多糖含量與籽粒硬度存在正相關(guān)關(guān)系[32]，這與臧容宇[4]在燕麥上的研究類似，硬質(zhì)燕麥糊粉層細(xì)胞壁厚度顯著高于軟質(zhì)燕麥，但李夢黎等[20]通過檢測β-葡聚糖含量，發(fā)現(xiàn)其與燕麥籽粒硬度的相關(guān)性不顯著。β-葡聚糖是燕麥重要的功能成分，其與籽粒硬度的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

3 麥類作物籽粒硬度分子機(jī)制研究進(jìn)展

3.1 小麥籽粒硬度的分子機(jī)制

麥類作物中，對小麥籽粒硬度的研究是最早開始的（圖3）。人們對小麥籽粒硬度的認(rèn)識始于19世紀(jì)末[33]，到20世紀(jì)后半葉，小麥分級制度的建立促進(jìn)了小麥籽粒硬度的遺傳研究。早期研究表明，籽粒硬度的遺傳力高，受一個或兩個主效基因和一些修飾基因控制[34]。到1986年，GREENWELL和SCHOFIELD[35]首次用1% SDS 從小麥水洗淀粉中發(fā)現(xiàn)了Frabilin 蛋白，使得小麥籽粒硬度的分子生物學(xué)研究有了突破性進(jìn)展。根據(jù)高效液體層析法和氨基酸序列分析，證實了Frabilin 蛋白主要由兩種蛋白構(gòu)成，因其富含色氨酸區(qū)域，故將其命名為puroindoline a（Pina）和puroindoline b（Pinb）[36-37]。Pinb 編碼的蛋白簡稱為PINA，Pinb 編碼的蛋白簡稱為PINB，二者氨基酸序列同源性達(dá)到60%。Pina和Pinb 基因啟動子上游序列的同源性高達(dá)78.4%，而轉(zhuǎn)錄起始位點后400 bp 范圍內(nèi)相似性為54.8%，且兩個蛋白質(zhì)氨基酸的差異主要發(fā)生在末端序列第10～20個氨基酸殘基之間[38]。PINA蛋白的缺失或編碼PINB蛋白的基因突變均造成小麥胚乳質(zhì)地變硬[2]。KRISHNAMURTHY 等[39]將野生型Pina和Pinb 基因轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻胚乳質(zhì)地明顯變軟。BEECHER 等[40]將我國春野生型Pinb 序列轉(zhuǎn)入硬粒小麥，使其在胚乳中表達(dá)，SKCS 硬度值由70 降為25。也就是說，小麥puroindoline 基因可以用于谷物籽粒硬度性狀的修飾。小麥在開花后10 d內(nèi)PIN 蛋白含量極低，從第15 天后開始快速增加，到32 d 到達(dá)最大值，軟質(zhì)麥的PIN 蛋白含量高于硬質(zhì)麥[41]。

表1 小麥籽粒硬度檢測方法

3.2 燕麥籽粒硬度的分子機(jī)制

燕麥籽粒硬度的研究比小麥晚。1998年，TANCHAK 等[42]發(fā)現(xiàn)了具有與小麥puroindoline 基因相似特點的兩對燕麥cDNA 克隆，分別是3B3-5、3B3-7和3B3T-3、3B3T-5。其中3B3和3B3T分別編碼147和142個氨基酸，均含有典型的10個半胱氨酸骨架和1個色氨酸豐富區(qū)，故命名為tryptophanins。該基因在燕麥、小麥、大麥和黑麥籽粒中特異性表達(dá)，在水稻籽粒中不存在。2000年，GAUTIER 等[43]利用小麥籽粒硬度基因Pina-D1和Pinb-D1的特異性引物在燕麥中PCR 擴(kuò)增得到了puroindoline-like的基因，并命名為avenoindolines。通過序列比對發(fā)現(xiàn)avenoindolines 與puroindolines的相似性要大于與tryptophanins的相似性。2015年，GAZZA等[44]在兩個普通栽培燕麥品種Donata和Primula中利用RT-PCR和Western blotting的方法并沒有檢測到Ainb的轉(zhuǎn)錄本和AINB蛋白，同時Aina的轉(zhuǎn)錄本和AINA蛋白的含量很低，表明AINA和AINB在燕麥籽粒硬度中的作用可能是微效的。但在水洗淀粉表面發(fā)現(xiàn)另外3個14 kDa的蛋白，都包含一個含4個色氨酸的疏水區(qū)，分別命名為Vromindoline 1（Vin-1）、Vromindoline 2（Vin-2）和Vromindoline 3（Vin-3），分別由Vin-1、Vin-2和Vin-3 基因編碼，且在燕麥A、C和D 基因組上都存在。通過向硬粒小麥（無Pina和Pinb的同源基因）Svevo 中轉(zhuǎn)化Vin-D2a和Vin-A3a 基因，均在轉(zhuǎn)基因后代中表達(dá)并在淀粉粒表面積累了其編碼的蛋白VIN-2.1和VIN-3.1，使得轉(zhuǎn)基因硬粒小麥Svevo的籽粒硬度降低約50%，表明vromindolines 基因確實可以引起籽粒硬度的改變，可以用于其他谷物籽粒硬度性狀的修飾。皮燕麥中，Vin-2 基因在開花后7 d開始表達(dá)，14 d 開始在淀粉顆粒表面積累，在21 d表達(dá)量達(dá)到峰值，28 d在淀粉顆粒表面積累到最大值，42 d后開始逐漸下降。

3.3 其他麥類籽粒硬度的分子機(jī)制

大麥、黑麥和小黑麥的籽粒硬度研究開展較晚。2001年，BEECHER 等[45]首次從8種常見的北美栽培大麥中克隆出Pina和Pinb的同源序列hordoindoline a（Hina）和hordoindoline b（Hinb），通過序列比對發(fā)現(xiàn)，大麥的序列含有非保守氨基酸替換。Hordoindolines 基因定位在大麥基因組的5H 上，該區(qū)域可以解釋22%的SKCS 硬度差異[46]。大麥中，HINA在開花后5 d 開始表達(dá)，8 d 是HINA表達(dá)的最高峰，20 d后表達(dá)量逐漸降低，而HINB在開花后8 d 才被發(fā)現(xiàn)，20 d 才逐漸減少[47]。

六倍體小黑麥?zhǔn)菍⑿←満秃邴溄?jīng)過人工雜交產(chǎn)生的一種新型作物，主要包括初級小黑麥和林保小黑麥兩種類型：初級小黑麥?zhǔn)怯捎擦Ｐ←満秃邴滊s交產(chǎn)生，不存在普通小麥具有的硬度位點而具有黑麥中的硬度位點，該位點編碼的Secaloindoline（SIN）蛋白能使胚乳質(zhì)地變軟；林保小黑麥?zhǔn)浅跫壭『邴溑c普通小麥雜交產(chǎn)生的后代，來自黑麥或者小麥的硬度位點都能夠遺傳給后代，在子代中硬度的變化范圍很大，從極軟到極硬都有分布[48]。小黑麥硬度位點位于5R 染色體上，包含兩個基因為Sina和Sinb，分別編碼SINA和SINB。研究發(fā)現(xiàn)，軟硬質(zhì)小黑麥secaloindoline 基因的編碼區(qū)完全一致，但二者表達(dá)的淀粉結(jié)合型Friabilin 差異很大，這可能是因為它們在啟動子區(qū)存在差異[49]（圖3）。

4 籽粒硬度與品質(zhì)性狀的關(guān)系

品質(zhì)性狀主要包括外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)等。加工品質(zhì)包括磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)兩個方面。衡量磨粉品質(zhì)的指標(biāo)主要包括出粉率、灰分含量和面粉色澤；食品加工品質(zhì)包括面粉品質(zhì)、面團(tuán)品質(zhì)、烘焙品質(zhì)和蒸煮品質(zhì)等。

小麥籽粒硬度對磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)均具有重要影響。硬質(zhì)小麥出粉率較高、破損淀粉顆粒多、吸水率高，發(fā)酵時易膨脹，適宜制作面包；軟質(zhì)小麥淀粉粒較細(xì)，制作出的面條口感爽滑[50]。研究表明，小麥籽粒硬度與灰分含量呈顯著或極顯著正相關(guān)[51]；燕麥籽粒硬度與灰分含量、面粉白度顯著相關(guān)，與脂肪含量、淀粉糊化溫度等相關(guān)性不顯著[12]；大麥籽粒硬度與籽粒的吸水性顯著負(fù)相關(guān)[52]。

麥類作物籽粒硬度基因及其不同的等位變異類型對其加工品質(zhì)也有重要影響。小麥籽粒硬度基因野生型Pina-D1a和Pinb-D1b的等位變異基因類型有很多，例如大片段缺失的變異類型，Pina-D1b（缺失15 380 bp）、Pina-D1r（缺失10 415 bp）、Pina-D1s（缺失4 420 bp）、Pina-D1u（缺失6 460 bp），還有一些由少數(shù)位點堿基突變和插入缺失產(chǎn)生的變異類型Pina-D1m、Pina-D1n、Pina-D1l，其中Pina-D1m 基因編碼的蛋白質(zhì)第35位的脯氨酸變?yōu)樯彼幔瑢?dǎo)致胚乳質(zhì)地變硬[53-56]。Pinb 也有多種等位變異基因，例如Pinb-D1h、Pinb-D1i、Pinb-D1j、Pinb-D1k、Pinb-D1m、Pinb-D1n、Pinb-D1o，這些均為多位點突變，表現(xiàn)為軟質(zhì)[57]。這些puroindoline 基因位點發(fā)生變異會導(dǎo)致小麥籽粒產(chǎn)生不同程度的硬度變化，進(jìn)而影響加工品質(zhì)。小麥面粉中增加puroindoline 蛋白利于改善面包結(jié)構(gòu)，使氣孔大小分布均勻，但會造成面包體積下降[58]。Pinb-D1b的小麥具有較好的磨粉品質(zhì)和優(yōu)良的面包體積[59]，比Pina-D1b的出粉率高、面粉顆粒大、黏度儀崩解值小[60]。Pinb-D1d 基因型小麥的出粉率、面粉亮度較高，饅頭色澤和張弛性評分較高，有較好的饅頭制作品質(zhì)；而Pinb-D1g和Pinb-D1e基因型的中國濕面條的評分較高[61]。

5 展望

目前，籽粒硬度的研究與前沿技術(shù)相結(jié)合，例如，已有研究利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對Pinb 基因啟動子區(qū)進(jìn)行編輯，為在小麥中實現(xiàn)Pinb 基因的定點突變奠定了基礎(chǔ)[62]；也有研究進(jìn)行了小麥籽粒硬度的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為進(jìn)一步探索小麥籽粒硬度的遺傳機(jī)制提供了參考[63]。

小麥籽粒硬度的研究較為系統(tǒng)且貼近生產(chǎn)生活，在研究深度和廣度上都走在其他麥類作物前列，但燕麥、大麥和黑麥等作為優(yōu)良的雜糧作物有廣闊的發(fā)展前景和更大的經(jīng)濟(jì)效益，可以為麥類作物育種提供更多優(yōu)異基因。麥類作物籽粒硬度遺傳機(jī)理的深入解析，對籽粒硬度優(yōu)異等位基因挖掘、分子標(biāo)記的開發(fā)、麥類作物品質(zhì)育種與改良以及指導(dǎo)生產(chǎn)生活等方面都有重要意義。