羅正東，高 平，雷曉凌，劉煥明，鐘 敏

海鞘桔青霉Asc2-4培養(yǎng)基和溶氧條件優(yōu)化對產(chǎn)油性能的影響

羅正東1，高 平2，雷曉凌1，劉煥明1，鐘 敏1

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2. 國家海產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(湛江)，廣東 湛江 524088）

【】優(yōu)化海鞘（）桔青霉（）Asc2-4培養(yǎng)基和溶氧條件，以提高其生物量和產(chǎn)油率。采用單因素法優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源及碳氮源比，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化無機(jī)鹽，采用組合法優(yōu)化溶氧條件，通過干質(zhì)量法、酸熱提油法及氣相色譜法評價優(yōu)化結(jié)果。經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化，確定碳源為葡萄糖，葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L，氮源種類為蛋白胨+酵母膏（1∶1），碳氮比為100，無機(jī)鹽配比為KH2PO44 g/L、MgSO4150 mg/L、FeCl330.0 μg/L；溶氧組合優(yōu)化條件為轉(zhuǎn)速220 r/min，250 mL錐形瓶裝液量100 mL。最終生物量和油脂質(zhì)量濃度分別提高至19.90、8.76 g/L，比未優(yōu)化前約提高1.5倍和20倍；發(fā)酵油的不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)53.37%，其中油酸和亞油酸皆達(dá)到26%以上。優(yōu)化后菌株的產(chǎn)油性能大幅提高，該菌有作為生產(chǎn)油酸和亞油酸的工業(yè)菌種潛力。

桔青霉；海鞘；產(chǎn)油性能；培養(yǎng)基優(yōu)化；溶氧條件優(yōu)化

微生物油脂是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物利用外源營養(yǎng)物質(zhì)合成并儲存在細(xì)胞內(nèi)的油脂[1]。海洋相較于陸地具有高鹽、高壓和低氧的極端特點(diǎn)，因此，海洋真菌具有獨(dú)特的產(chǎn)油性質(zhì)[2]。海鞘 () 為脊索動物門，尾索亞門，海鞘綱動物。柴慧子等[3]在雷州海鞘中篩選出一株產(chǎn)油桔青霉（）Asc2-4，其不飽和脂肪達(dá)到65.00%，具有開發(fā)微生物功能性油脂的潛力。迄今，將海鞘共附生微生物開發(fā)為油脂工業(yè)菌的發(fā)酵研究鮮有報道。

產(chǎn)油真菌一般可利用多種碳源生長，積累油脂。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)油真菌的適宜碳源一般為甘油和葡萄糖[4]。碳源的濃度可影響產(chǎn)油真菌的油脂含量和不飽和組分，裂殖壺菌（sp. S31）在25 g/L的低葡萄糖質(zhì)量濃度條件下可促進(jìn)生成DHA，而100 g/L高葡萄糖質(zhì)量濃度下可提高脂質(zhì)含量[5]。不同產(chǎn)油真菌的適宜氮源種類不同，馬治燦[6]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)油鐮刀霉（sp.WHJ13）的最適單一氮源為硝酸鉀。碳氮比過高不利于生物量的提高，碳氮比過低易使發(fā)酵時間延長[7]。金屬離子可影響產(chǎn)油微生物胞內(nèi)外滲透壓和酶活力，從而影響產(chǎn)油微生物的油脂合成能力[8]。薛漢明等[9]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+對三角褐指藻（Bohlin）的去不飽和酶活性有促進(jìn)作用。有研究表明，低濃度的Mg2+對單針藻（sp. FXY-10）生物量和油脂濃度均有促進(jìn)作用[10]。轉(zhuǎn)速及裝液量決定培養(yǎng)基的溶氧條件，影響菌體生長和產(chǎn)油量。鐘琦等[11]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速120 r/min和每瓶 (250 mL) 空氣量70 mL的條件可促進(jìn)油脂酵母（HL）的生物量增長，對油脂產(chǎn)量影響程度較小。目前，針對提高真菌產(chǎn)油的研究主要在培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件。本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基及溶氧條件，提高桔青霉Asc2-4的生物量和油脂濃度，為該菌規(guī)模化生產(chǎn)功能性油脂研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基 菌株：桔青霉（）Asc2-4分離自廣東省雷州市流沙蝦塘的海鞘（），保存于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號GDMCC 60059。

種子培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯浸出粉8，葡萄糖20，海精鹽15，硫酸銨10。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖120，馬鈴薯200（去皮，切碎，加蒸餾水煮沸15 min，濾渣），檸檬酸鈉0.1，磷酸氫二鉀0.2，磷酸二氫鉀2.0，酵母膏0.5，硫酸銨2，海精鹽15。發(fā)酵前后pH在5.7 ~ 5.8之間。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備 HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BMJ-25型霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GC-2010PLUS氣相色譜儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)與發(fā)酵 種子培養(yǎng)：挑取一環(huán)孢子接種于裝有200 mL種子培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶，在搖床中以28 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)2 d。

搖床發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)后的種子液按體積分?jǐn)?shù)5%接種于含200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在搖床中以28 ℃、140 r/min條件發(fā)酵7 d。

1.2.2 碳氮源單因素優(yōu)化 碳源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：葡萄糖、麥芽糖、甘油、乳糖和蔗糖。碳源濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)為50、75、100、125、150 g/L。氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、尿素和牛肉膏，按質(zhì)量比1∶1的比例添加酵母膏。碳氮源比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：碳源（葡萄糖）濃度固定的前提下，添加不同濃度優(yōu)化后的氮源，使碳、氮源質(zhì)量比分別為40、60、80、100、120。

1.2.3 無機(jī)鹽正交優(yōu)化 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，從8種無機(jī)鹽KH2PO4、NaH2PO4、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、FeCl3、ZnSO4和CoCl2中篩選3種明顯提高產(chǎn)油量的無機(jī)鹽KH2PO4、MgSO4和FeCl3，并以產(chǎn)油量為指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平（表1）正交試驗(yàn)L9（33）。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平

1.2.4 溶氧條件組合優(yōu)化 將搖床轉(zhuǎn)速140、180、220、260 r/min分別與250 mL錐形瓶裝液量100、150、200 mL設(shè)置成12組不同溶氧條件，通過優(yōu)化，確定最佳的轉(zhuǎn)速及裝液量。

1.2.5 評價指標(biāo) 1）生物量測定。生物量采用細(xì)胞干質(zhì)量法[12]測定，將菌絲置于109 ℃的烘箱中烘干，稱取質(zhì)量。

生物量計算：干菌生物量（g/L）=（帶干菌體培養(yǎng)皿質(zhì)量? 培養(yǎng)皿質(zhì)量）/ 發(fā)酵培養(yǎng)皿體積

2）油脂濃度。采用酸熱法[13]提取油脂：按每1.00 g的干菌體添加4.00 mol/L的鹽酸6.00 mL，置室溫下30 min，沸水浴加熱10 min，?20 ℃下速凍，反復(fù)2至3次，加入2倍體積的氯仿-甲醇（體積比2∶1），振蕩，以2 000 r/min離心15 min，揮發(fā)有機(jī)相即得油脂。

油脂質(zhì)量濃度（g/L）= 總油脂質(zhì)量/ 發(fā)酵培養(yǎng)基體積。

3）脂肪酸組分。樣品甲酯化[14]，使用氣相色譜儀分析脂肪酸組分。

氣相色譜條件：SP-2560氣相毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm×0.2μm）；檢測器為氫火焰離子檢測器（FID）；進(jìn)樣口溫度225℃；檢測器溫度250℃；分流比10∶1。程序升溫條件：柱溫100 ℃，維持13 min；以10 ℃/min升至180 ℃，維持6 min；再以1 ℃/min升至200 ℃，維持20 min；再以4 ℃/min升至235 ℃，維持20 min。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用軟件SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析（ANOVA）和Duncan多重比較，判斷組間顯著性差異，= 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮源及碳氮源比單因素優(yōu)化

2.1.1 碳源優(yōu)化 由圖1可知，桔青霉Asc2-4可利用此5種碳源合成油脂。蔗糖、麥芽糖和甘油的生物量相近，分別為5.65、5.00、5.78 g/L，油脂質(zhì)量濃度亦相近，分別為0.32、0.35、0.25 g/L，該菌對3種碳源的利用能力相近。桔青霉Asc2-4對乳糖的利用效率最低。葡萄糖作為碳源時生物量最高（< 0.05），達(dá)7.35 g/L，油脂質(zhì)量濃度為0.40 g/L。因此，葡萄糖可提高顯著該菌生物量（< 0.05），而5種碳源對油脂質(zhì)量濃度影響不顯著（> 0.05），確定葡萄糖為最適碳源。

同一指標(biāo)凡含一個相同字母則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）

2.1.2 碳源濃度優(yōu)化 圖2表明，桔青霉Asc2-4生物量隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加呈先升后降變化趨勢，100、150 g/L時生物量最高（< 0.05）；而油脂質(zhì)量濃度呈降低趨勢，150 g/L時最低（< 0.05）。在葡萄糖質(zhì)量濃度為150 g/L時，生物量和油脂濃度出現(xiàn)下降可能是因?yàn)槠咸烟菨舛冗^高，菌體生長與油脂積累出現(xiàn)抑制[15]。葡萄糖為100 g/L時的生物量和油脂質(zhì)量濃度平均值均最高（分別為8.33 g/L和0.56 g/L），為最適濃度。

同一指標(biāo)凡含一個相同字母則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）

2.1.3 氮源優(yōu)化 圖3表明，對于無機(jī)氮源而言，硫酸銨比硝酸鉀更利于菌體生長和積累油脂，可知該菌對氨基氮源利用效率比硝基氮源高。對于有機(jī)氮源為蛋白胨時，桔青霉Asc2-4的生物量和油脂濃度均最高，平均值分別為8.78、2.71 g/L，蛋白胨相較于其他氮源對于提高油脂濃度效果最為顯著（< 0.05），因此，桔青霉Asc2-4的最適氮源為蛋白胨（圖3）。對比氮源硫酸銨和蛋白胨，該菌的生物量相近（> 0.05），而前者油脂濃度降低，平均值分別為0.46 g/L和0.75 g/L，可見，蛋白胨更利于該菌積累油脂，可能與蛋白胨所含刺激產(chǎn)油的必需營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)[16]。

同一指標(biāo)凡含一個相同字母則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）

2.1.4 碳氮源比的優(yōu)化 圖4表明，碳氮源比在40 ~ 80的范圍內(nèi)，生物量平均值呈下降趨勢，而油脂濃度平均值逐漸升高，可能是因?yàn)榈礈p少，菌體生長受抑制，菌體因氮源含量逐漸降低而進(jìn)入油脂積累階段，從而提高油脂積累量[17]。碳氮源比為100時，油脂濃度最高，平均值達(dá)到2.71 g/L，生物量平均值為11.59 g/L（圖4），表明該菌在高碳氮比的條件下更有利于油脂合成。碳氮源比為120時生物量及油脂濃度均顯著下降，可能是因?yàn)榈床蛔阆拗屏司z生長，從而油脂合成受到抑制[18]。

同一指標(biāo)凡含一個相同字母則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）

2.2 無機(jī)鹽正交優(yōu)化

正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果如表2所示。

表2 無機(jī)鹽正交試驗(yàn)結(jié)果

表2可見，KH2PO4、MgSO4和FeCl3三種無機(jī)鹽的數(shù)據(jù)均值最高水平分別為A2、B3、C1，所以無機(jī)鹽添加量的最佳濃度為A2B3C1，即KH2PO44.0 g/L、MgSO4150.0 mg/L、FeCl330.0 μg/L，且影響因素A＞C＞B，KH2PO4對菌株發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響最大，MgSO4和FeCl3在影響油脂濃度方面存在較大的交互作用。經(jīng)無機(jī)鹽優(yōu)化后油脂濃度達(dá)到4.73 g/L，提高42%。

2.3 溶氧條件組合優(yōu)化

由圖5A可知，180 r/min的轉(zhuǎn)速條件最有利于菌體生長，在轉(zhuǎn)速180 r/min、250 mL錐形瓶裝液量（下稱“裝液量”）100 mL，轉(zhuǎn)速180 r/min、裝液量150 mL的條件下，該菌的生物量較高，平均值分別達(dá)到20.39、20.62 g/L。而在260 r/min的高轉(zhuǎn)速條件下，生物量在11.79 ~ 17.44 g/L之間，仍然較高，表明該菌具有較高的抗液態(tài)剪切力能力，該特性對工業(yè)產(chǎn)油具有重要意義[19]。如圖5B所示，該菌在轉(zhuǎn)速140 ~ 260 r/min的范圍內(nèi)，油脂濃度呈現(xiàn)先升高后下降，220 r/min為適宜油脂積累的轉(zhuǎn)速條件。其中，轉(zhuǎn)速220 r/min、裝液量100 mL的溶氧條件下最利于產(chǎn)脂，油脂質(zhì)量濃度達(dá)到最高，為8.76 g/L。因此，確定轉(zhuǎn)速220 r/min及裝液量100 mL為最適產(chǎn)油的溶氧條件。

裝液量指250 mL錐形瓶中的裝液量；同裝液量凡含一個相同字母則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05）

2.4 優(yōu)化條件后桔青霉Asc2-4的油脂脂肪酸組分

由表3可知，優(yōu)化條件后桔青霉Asc2-4油脂主要為C16和C18系脂肪酸，含量最高的四種脂肪酸依次為亞油酸（C18:2）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、棕櫚酸（C16:0），其中功能價值較高的脂肪酸為油酸和亞油酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為26.05%和26.67%，該兩種脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)52.72%。桔青霉Asc2-4所產(chǎn)油脂脂肪酸組分與Kyle等[20]研究的油脂酵母（）相似，但是桔青霉Asc2-4的亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約高23%。綜上可知，桔青霉Asc2-4可用于生產(chǎn)功能性油脂油酸和亞油酸。

表3 優(yōu)化條件后桔青霉Asc2-4油脂的脂肪酸組成

說明：1）在總脂肪酸中的比例。

Note: 1) Percentage of fatty acid to total fatty acid.

3 結(jié)論

桔青霉Asc2-4最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖100 g/L、蛋白胨0.5 g/L、酵母膏0.5 g/L、KH2PO44 g/L、MgSO4150 mg/L、FeCl330.0 μg/L；最佳溶氧條件為轉(zhuǎn)速220 r/min、250 mL錐形瓶裝液量100 mL。優(yōu)化后生物量和油脂質(zhì)量濃度分別達(dá)19.90 g/L和8.76 g/L，分別比未優(yōu)化前約提高1.5倍和20倍。不飽和脂肪酸占總脂肪酸的53.37%，油酸和亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為26.05%和26.67%。桔青霉Asc2-4有作為產(chǎn)功能性油脂的工業(yè)生產(chǎn)菌株潛力，有開發(fā)研究的價值。

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Optimization of Culture Medium and Dissolved Oxygen for Improving Oil-producing Properties ofAsc2-4 from

LUO Zheng-dong1, GAO Ping2, LEI Xiao-ling1, LIU Huan-min1, ZHONG Min1

（1.////,524088,; 2.N(),524088,）

To improve the biomass and oil yield ofAsc2-4 fromby optimizing the culture medium and dissolved oxygen and to provide the basis for industrial production.The carbon and nitrogen sources and the ratio of C source to N source (C/N) in the medium were optimized by a single factor, the inorganic salts by orthogonal method, and the dissolved oxygen by combination method. The optimization results were evaluated by dry weight method, acid-hot oil extraction method and gas chromatography.The optimal medium consist of a carbon source that was glucose with the concentration of 100 g/L, a nitrogen source with peptone+yeast extract (1∶1), a C/N of 100, inorganic salt content of KH2PO44 g/L, MgSO4150 mg/L, FeCl32.0 μg/L. The optimal combination conditions of dissolved oxygen were determined that the rotation speed was 220 r/min, loading volume was 100 mL in 250 mL conical flask. Finally, biomass and oil mass concentration were increased to 19.90 g/L and 8.76 g/L respectively, which were 1.5 times and 20 times higher than unoptimized control. The content of unsaturated fatty acid in the fermented oil was 53.4%, among which oleic acid and linoleic acid was over 26%.The optimization of medium and dissolved oxygen can greatly improve oil-producing properties of the strain, which has the potential to be used as an industrial strain for producing oleic acid and linoleic acid.

;; oil-producing properties; medium optimization;dissolved oxygen optimization

Q949.32

A

1673-9159（2020）06-0102-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.013

羅正東，高平，雷曉凌，等. 海鞘桔青霉Asc2-4培養(yǎng)基和溶氧條件優(yōu)化對產(chǎn)油性能的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（6）：102-107.

2019-11-14

湛江市科技計劃項(xiàng)目（2016A02020）

羅正東（1993—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笳婢Y源研究。E-mail: 794008688@qq.com

雷曉凌（1963—），女，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楹Ｑ笳婢盎钚晕镔|(zhì)研究。E-mail: 1252765610@qq.com

（責(zé)任編輯：劉慶穎）