黎楚怡，熊新威，杜曉東,2

馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

黎楚怡1，熊新威1，杜曉東1,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088）

【】?jī)?yōu)化馬氏珠母貝（）雙鏈RNA干擾實(shí)驗(yàn)的條件。注射不同次數(shù)的干擾探針進(jìn)行不同時(shí)間的干擾，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)基因的表達(dá)；通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察貝殼珍珠層內(nèi)表面新生層的生長(zhǎng)并分析不同組別貝殼的生長(zhǎng)情況。注射60 μg探針1次時(shí)，實(shí)驗(yàn)組基因在外套膜套膜區(qū)相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組基因6 d的相對(duì)表達(dá)量顯著低于4 d；注射60 μg探針2次時(shí)，8 d基因在外套膜套膜區(qū)的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，所有實(shí)驗(yàn)組貝殼珍珠層均出現(xiàn)無(wú)序生長(zhǎng)；與實(shí)驗(yàn)組4 d和8 d相比，6 d時(shí)新生珍珠層新生層邊界完全被破壞，并且出現(xiàn)更多散亂的細(xì)小晶體。注射60 μg雙鏈RNA探針1次并在6 d后收集樣品，為馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾實(shí)驗(yàn)探究基因功能的穩(wěn)定高效條件。

馬氏珠母貝；雙鏈RNA干擾；優(yōu)化

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在轉(zhuǎn)錄水平誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象[1]。RNA干擾的作用機(jī)理：（1）起始階段：外源dsRNA被Dicer酶切割成大小約21 ~ 23 bp的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）；（2）效應(yīng)階段：siRNA雙鏈結(jié)合核酶復(fù)合物，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC中siRNA變性解開(kāi)雙鏈，反義鏈結(jié)合在復(fù)合物上，并引導(dǎo)RISC與同源的靶mRNA結(jié)合，在核酸內(nèi)切酶的作用下，自siRNA中點(diǎn)位置處將靶mRNA切斷，阻斷其翻譯成蛋白質(zhì)[2-3]；（3）擴(kuò)增階段：以siRNA中的一條鏈為引物、靶mRNA為模板，在RNA介導(dǎo)的RNA聚合酶作用下，擴(kuò)增靶mRNA，產(chǎn)生新的siRNA反作用于靶mRNA，使其降解[3]。

昆蟲(chóng)進(jìn)行RNAi多數(shù)采用顯微注射dsRNA、飼喂法。飼喂法主要通過(guò)將dsRNA導(dǎo)入細(xì)菌或混入食物、能表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物喂養(yǎng)昆蟲(chóng)[4-5]；在抗病毒感染方面主要是針對(duì)病毒的保守序列、宿主細(xì)胞表面受體基因合成siRNA及構(gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射及其構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體進(jìn)入小鼠體內(nèi)抑制病毒[6-7]；在植物基因功能研究中通常構(gòu)建含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA（hairpin RNA，hpRNA）T-DNA質(zhì)?；蚝瑑?nèi)含子的ihpRNA（intron-containing hairpin RNA），利用基因槍整合至細(xì)胞、農(nóng)桿菌介導(dǎo)dsRNA轉(zhuǎn)化整合至染色體[8-9]；甲殼動(dòng)物RNAi一般體外轉(zhuǎn)錄和載體構(gòu)建合成dsRNA或siRNA并將其注射到血淋巴、肌肉或卵粒中，或?qū)?dòng)物組織與雙鏈RNA進(jìn)行離體培養(yǎng)[10]?；驑尫ㄖ荒苁怪参锘虍a(chǎn)生瞬時(shí)沉默效應(yīng)，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)體內(nèi)表達(dá)dsRNA可獲得長(zhǎng)效并穩(wěn)定遺傳的基因沉默效應(yīng)[8]；飼喂法因dsRNA或siRNA容易被降解，沉默效果較差，但不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象造成損傷，適用于動(dòng)物體；注射法需要實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行血液循環(huán)，使dsRNA或siRNA迅速到達(dá)靶組織，但是操作要求高，操作參數(shù)需要優(yōu)化，體型小的昆蟲(chóng)等容易被注射操作的機(jī)械損傷而導(dǎo)致死亡[5]。雙殼類軟體動(dòng)物的體型相對(duì)昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)較大，雙殼類軟體動(dòng)物具有開(kāi)管式血液循環(huán)系統(tǒng)，血液可以浸入各個(gè)組織器官與其進(jìn)行物質(zhì)交換，雙鏈RNA干擾探針通過(guò)注射法進(jìn)入體內(nèi)，可快速達(dá)到靶組織、靶器官對(duì)靶基因進(jìn)行干擾。

Pif是馬氏珠母貝中研究較為透徹的一個(gè)基質(zhì)蛋白，RMKR是翻譯加工中經(jīng)常觀察到的一個(gè)Kex2-like蛋白酶裂解位點(diǎn)，前體蛋白pif 177通過(guò)修飾切割形成Pif 80、Pif 97[11-12]。Pif 80、Pif 97分別位于Pif蛋白的C、N末端[13]，多肽Pif 80-11促進(jìn)文石在β-幾丁質(zhì)基質(zhì)上成核[11]；Pif 97蛋白具有VWFA（Von Willebrand factor type A domain）和CHIT_BIND_II（Chitin-binding type-2 domain），能結(jié)合幾丁質(zhì)框架并促使片層結(jié)構(gòu)的形成[14]。鄭哲[15]研究結(jié)果顯示let-7e、miR-2305 的過(guò)表達(dá)能使基因表達(dá)的顯著性下調(diào)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)貝珍珠層結(jié)晶出現(xiàn)紊亂；董冰冰等[16]研究結(jié)果表明基因表達(dá)量呈現(xiàn)隨pH降低而降低的變化趨勢(shì)，海水酸化影響鈣沉積，引起珍珠層形貌特征的變化。Suzuki M等[11]通過(guò)注射dsRNA干擾，其表達(dá)水平顯著降低并觀察到珍珠層無(wú)序生長(zhǎng)。作為典型的礦化基因，其表達(dá)量高低已被用于評(píng)估珍珠貝在胚胎發(fā)育，殼損傷修復(fù)等過(guò)程是否發(fā)生了礦化的參考。

馬氏珠母貝（），隸屬于軟體動(dòng)物門，雙殼綱，珍珠貝目，珍珠貝科，珠母貝屬[17]，是我國(guó)人工培育海水珍珠的主要經(jīng)濟(jì)貝類之一。貝殼是典型的生物礦化材料[15]，RNA干擾技術(shù)是探究基質(zhì)蛋白礦化功能的重要技術(shù)。然而在雙殼貝類，已有研究表明，通過(guò)RNA干擾探究基因功能的方法參差不齊，還沒(méi)有專門針對(duì)雙鏈RNA干擾條件的研究可供參考。本研究選用馬氏珠母貝典型礦化基因作為干擾對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室前期較成熟的RNA干擾條件下，比較3種不同干擾條件的干擾效果，明確馬氏珠母貝雙鏈RNA干擾的最佳條件，優(yōu)化縮短RNA干擾的實(shí)驗(yàn)周期和RNA干擾探針用量，為后期馬氏珠母貝基因功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為1.5齡馬氏珠母貝，殼長(zhǎng)5 ~ 6 cm。材料來(lái)源于廣東省湛江市雷州市覃斗鎮(zhèn)后洪村。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Reverse Transcriptase M-MLV、Recombinant RNase Inhibitor (40 U/μL)、5XM-MLV Buffer、pMDTM 18-T Vector Cloning Kit、Premix TaqTM (TaKaRa TaqTM Version 2.0)購(gòu)自大連寶生物公司，SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自Clontech Corporation，Trizol、SYBR? Select Master Mix購(gòu)自Life Technologies Corporation，GeneJET Gel Extraction Kit購(gòu)自Thermo Scientific、

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)已獲得序列全長(zhǎng)，利用Primer Premier 5 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物（實(shí)驗(yàn)所需用到的引物詳見(jiàn)表1）。分別在上、下游引物的5′端加上T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列（表1下劃線部分，序列為GCGTAATACGACTCACTATAGGG），隨后由上海生工公司合成引物。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列

1.2.2 mRNA的提取及cDNA第一鏈的合成 運(yùn)用Trizol法提取外套膜組織的總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其完整性，Nano Drop 2000核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度及純度。參照Reverse Transcriptase M-MLV說(shuō)明書，操作合成cDNA第一鏈。

1.2.3 探針制備 采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增對(duì)中間片段進(jìn)行擴(kuò)增。先通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，后根據(jù)純化回收試劑盒說(shuō)明書純化目的基因；回收目的基因片段導(dǎo)入到pMD-18T載體中，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，對(duì)目的菌進(jìn)行保種并送至生工生物工程（上海）股份有限公司分部廣州測(cè)序部測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的目的菌進(jìn)行質(zhì)粒提取作為體外轉(zhuǎn)錄合成探針的模板。按照Thermo Scientific體外轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書進(jìn)行探針的合成，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA的完整性（圖1），用核酸定量?jī)x檢測(cè)dsRNA的濃度和純度；用DEPC水將dsRNA的濃度稀釋為600 ng/μL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)dsRNA-Pif和dsRNA-RFP

1.2.4 RNA干擾 RNA干擾實(shí)驗(yàn)方法參照鄭哲[15]、董冰冰等[18]文獻(xiàn)提到方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。挑選規(guī)格一致健康的30只馬氏珠母貝，隨機(jī)分成3組，1組實(shí)驗(yàn)組（注射dsRNA-）；一組陰性對(duì)照組（注射dsRNA－RFP）和一組空白對(duì)照組（注射DEPC水），每組10只，每只注射探針濃度為600 ng/μL，劑量為100 μL。實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用工業(yè)生產(chǎn)使用的排貝法并采用微量注射器往閉殼肌中注射探針。

每組按照以下實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理：

（1）注射一次探針，在4 d和6 d時(shí)分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組8只馬氏珠母貝迅速分離馬氏珠母貝的外套膜區(qū)，將其放入液氮罐中速凍保存，并將對(duì)應(yīng)的貝殼做好標(biāo)記，置于封口袋中保存。

（2）以4 d為周期單獨(dú)注射共2次，在8 d時(shí)分別將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組8只馬氏珠母貝迅速分離馬氏珠母貝的外套膜區(qū)，將其放入液氮罐中速凍保存，并將對(duì)應(yīng)貝殼做好標(biāo)記，置于封口袋中保存。

實(shí)驗(yàn)收集的所有組織樣品按照1.2.2的方法進(jìn)行總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板第一鏈，再利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，方法見(jiàn)1.2.5。挑取基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)的貝體貝殼，使用切割機(jī)將貝殼珍珠層和棱柱層交界部分以1 cm×1 cm的規(guī)格切塊，隨后用去離子水溫和地沖洗干凈，置于陰涼通風(fēng)處晾干，經(jīng)離子濺射儀濺射3 min，用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope）觀察貝殼內(nèi)表面珍珠層結(jié)晶形貌的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈作為模板，馬氏珠母貝的β-actin基因作為實(shí)時(shí)熒光定量的內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行復(fù)孔的重復(fù)。采用2–ΔΔCT法對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS 19.0軟件單因素方差分析對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA干擾后熒光定量

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)馬氏珠母貝基因在外套膜區(qū)的相對(duì)表達(dá)量。注射一次探針后，實(shí)驗(yàn)組在4 d和6 d時(shí)基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組出現(xiàn)顯著性降低，且6 d時(shí)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于4 d（圖2 A，表2）。以4 d為注射周期，注射2次探針后，在8 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（圖2 B，表2）。實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著性差異。

表2 單因素方差分析參數(shù)

標(biāo)注不同字母表示組內(nèi)存在差異顯著（< 0.05），標(biāo)注*和**表示組間存在差異顯著（< 0.05）

Mean values with different letters are significant different in the group(<0.05)； the labels * and ** are significant difference between the groups (<0.05)

圖2 RNA干擾后4 d、6 d和8 d基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 2 The relative expression ofgenes in 4 , 6 and 8 days after RNA interference

2.2 RNA干擾后貝殼的超微結(jié)構(gòu)

通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察貝殼內(nèi)層新生層，空白對(duì)照（DEPC組）和陰性對(duì)照組（RFP組）馬氏珠母貝珍珠層結(jié)晶形態(tài)為清晰的橢圓型或多邊形，界限清晰明顯，各板塊結(jié)晶排列緊密，結(jié)晶體和結(jié)晶層排列規(guī)則且表面光滑平整（圖3_1，圖3_2，圖3_5，圖3_6，圖3_9，圖3_10）。是參與珍珠層形成的基因，可控制文石在多糖基質(zhì)的成核并形成多邊形片結(jié)構(gòu)[13, 19]，經(jīng)過(guò)注射dsRNA－探針進(jìn)行干擾后珍珠層生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)紊亂。不規(guī)則、晶體的晶型基本被破壞（圖3_7）且在3 000倍下可明顯看見(jiàn)邊界處出現(xiàn)很多不規(guī)則細(xì)小晶體（圖3_8），干擾效果最為顯著；4 d的珍珠層出現(xiàn)紊亂生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖3_3），晶體晶型無(wú)序生長(zhǎng)，排列不規(guī)則，3 000倍下邊界沒(méi)有細(xì)小晶體（圖3_4），干擾效果較好；以4 d為注射周期，注射2次dsRNA－探針干擾后，8 d時(shí)貝殼珍珠層內(nèi)表面形貌結(jié)構(gòu)亦發(fā)生了紊亂生長(zhǎng)（圖3_11），3 000倍下邊界還能區(qū)分部分珍珠質(zhì)板層邊界且出現(xiàn)少量細(xì)小晶體（圖3_12），干擾效果較差。

1、5、9是空白對(duì)照組貝殼珍珠層的超微結(jié)構(gòu)，2、6、10是陰性對(duì)照組貝殼珍珠層的超微結(jié)構(gòu)，3、7、11是注射dsRNA-Pif后貝殼珍珠層的超微結(jié)構(gòu)；4、8、12分別是對(duì)3、7、11珍珠層局部的放大圖

3 討論

雙鏈RNA干擾是通過(guò)導(dǎo)入外源雙鏈RNA，形成RISC復(fù)合物以切斷體內(nèi)目標(biāo)基因mRNA序列，從而降低基因表達(dá)水平的一種技術(shù)，是研究基因功能的重要技術(shù)。目前在雙殼類中主要方法是通過(guò)開(kāi)貝鉗撬開(kāi)貝殼、注射探針，并于一定時(shí)間后進(jìn)行取樣檢測(cè)。文獻(xiàn)檢索顯示[11,20-24]，進(jìn)行RNA干擾時(shí)，在注射的濃度、劑量和干擾持續(xù)的時(shí)間上存在差異，沒(méi)有專門的參考標(biāo)準(zhǔn)。

RNA干擾效果存在劑量效應(yīng)。Suzuki等[11]采用濃度分別為5、15和30 μg的RNAi探針，結(jié)果顯示隨著探針濃度增加，基因表達(dá)水平降低；甲干初[20]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射40、80 μg RNAi探針基因表達(dá)量與對(duì)照組相比分別下降60%、65%，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)注射40 μg的貝殼內(nèi)表面邊緣發(fā)生卷皺、晶體無(wú)序堆積，而注射80 μg的貝殼的晶體無(wú)序堆積更為明顯；黃榮蓮等[21]采用注射60 μg的RNAi探針，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組馬氏珠母貝外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)的表達(dá)量分別下調(diào)61.42%和45.15%，顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)珍珠層、棱柱層晶體生長(zhǎng)紊亂、排列混亂。通過(guò)對(duì)比甲干初、黃榮蓮等貝殼微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，隨著RNAi探針濃度增加，貝殼內(nèi)表面新生層的晶體排列混亂程度、結(jié)晶板塊的形態(tài)等超微結(jié)構(gòu)加深，而基因表達(dá)量均可顯著下調(diào)。盡管RNA干擾效果存在劑量效應(yīng)，但濃度劑量越大，制備雙鏈RNA干擾探針的成本就會(huì)越高。本實(shí)驗(yàn)室前期，通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)查，已成功將RNA干擾技術(shù)運(yùn)用于馬氏珠母貝基因功能研究，實(shí)驗(yàn)條件：RNAi探針用量為60 μg，注射2次，2次注射間隔周期為4 d，在距離第一次注射8 d時(shí)進(jìn)行樣品收集[21]。該方法雖然能夠取得較好干擾效果，卻存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本較高等缺陷。目前2次注射仍是實(shí)驗(yàn)室前期常用實(shí)驗(yàn)條件，由于RNA干擾效果還存在時(shí)間依賴性，為探究在同樣注射劑量條件下，能否在減少注射次數(shù)、縮短實(shí)驗(yàn)周期前提下達(dá)到同樣實(shí)驗(yàn)效果。本實(shí)驗(yàn)在同樣注射60 μg RNAi干擾探針的情況下，將單次注射并分別在4 d和6 d收集樣品作為實(shí)驗(yàn)組；以2次注射后，距離第一次注射8 d取樣作為陽(yáng)性對(duì)照。

RNA干擾效果的時(shí)間依賴性。何國(guó)平等[22]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在12 h時(shí)開(kāi)始略有降低、48 ~ 72 h降低最明顯，而在96 h恢復(fù)到正常表達(dá)水平；曾永秋等[23]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后12 h即對(duì)mRNA的表達(dá)產(chǎn)生抑制，48 h抑制率最高，72 h后抑制率下降。上述研究表明，RNA干擾效果由時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)由弱到強(qiáng)、再由強(qiáng)到弱的逐漸消失趨勢(shì)[22]。為探究馬氏珠母貝注射探針后的時(shí)間依賴性，本次實(shí)驗(yàn)注射了60 μg雙鏈RNA干擾探針1次，檢測(cè)了4 d和6 d時(shí)的干擾效果。結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組基因的相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)顯著下調(diào)，貝殼珍珠層均出現(xiàn)紊亂生長(zhǎng)。但6 d時(shí)，表達(dá)量顯著低于4 d且珍珠層新生層的紊亂生長(zhǎng)程度也較4 d時(shí)明顯。這說(shuō)明60 μg雙鏈RNA干擾探針的注射劑量已經(jīng)達(dá)到明顯的干擾效果，且6 d時(shí)RNA干擾作用仍在持續(xù)。本研究還采用本實(shí)驗(yàn)室前期使用方法進(jìn)行了一組實(shí)驗(yàn)，以比較兩種方法差異。結(jié)果表明，注射2次探針時(shí)（4 d/次），8 d時(shí)基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著下調(diào)，貝殼珍珠層出現(xiàn)紊亂生長(zhǎng)。雖然8 d時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量低于注射一次探針4 d和6 d，但是從對(duì)貝殼珍珠層影響程度來(lái)看，8 d的較注射一次探針6 d的弱。吳偉東等[24]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在0.01 ~ 0.08 μmol/L范圍隨著dsRNA-eGFP濃度增加，RNAi效應(yīng)明顯增強(qiáng)，而增加到0.16 μmol/L并不能進(jìn)一步增強(qiáng)抑制效應(yīng)，說(shuō)明濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致干擾效應(yīng)被減弱，甚至被消除。8 d珍珠層紊亂效果弱于6 d的現(xiàn)象可能是由于兩次注射后，體內(nèi)探針濃度過(guò)高，導(dǎo)致干擾效應(yīng)被削弱。此外，還有可能是因?yàn)榛虮婚L(zhǎng)時(shí)間沉默，替補(bǔ)基因被激活，以至于導(dǎo)致基因的相對(duì)表達(dá)量更低下調(diào)而沒(méi)有造成對(duì)應(yīng)程度的微觀結(jié)構(gòu)變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明注射1次探針且干擾6 d后進(jìn)行取樣時(shí)，實(shí)驗(yàn)組貝殼內(nèi)表面珍珠層晶體明顯出現(xiàn)紊亂且文石板層間出現(xiàn)大量不規(guī)則細(xì)小晶體，說(shuō)明注射探針1次、干擾6 d后取樣為最優(yōu)條件。

綜合分析，本研究認(rèn)為注射60 μg探針1次，注射后6 d可收集樣本進(jìn)行檢測(cè)。該方法成本低，周期短，效率高，可作為馬氏珠母貝RNA干擾條件的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，為后期馬氏珠母貝基因功能的研究提供參考。

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Optimization of Double-stranded RNA Interference Experiments of

LI Chu-yi1，XIONG Xin-wei1，DU Xiao-dong1,2

（1./2.,524088,）

The conditions of the double-stranded RNA interference experiment ofwere optimized.The pearl oysters were injected by the probe with a different number of times and different interfering times. The expression level ofgene was detected using Real-time fluorescence quantification PCR. The inner surface of shell nacreous layer was observed and the growing situation of a new layer in the different group was analyzed.When 60 μg probes were injected once, the relative expression level ofgene in the experimental group was significantly lower than that in the control group, and relative expression ofgene in the experiment group at the 6th day was significantly lower than that at the 4th day. When 60 μg probes were injected twice, the relative expression level ofgene in the experimental group was significantly lower than that in the control group on 8th day. The result of scanning electron microscopy indicated that all the new growth nacreous layers in the experimental group exhibited the disordered growth; compare with the 4th and 8th days, the ordered boundary on the new nacre was destroyed completely and more small crystal was arranged irregularly.The best stable and efficient conditions of the double-stranded RNA interference ofwere: inject 60 μg double-stranded RNA probes once and collect the sample at 6 days postinjection. These optimized conditions would contribute to the exploration of gene function in.

; double-stranded RNA interference; optimization

S917.4

A

1673-9159（2020）06-0009-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.06.002

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2020-06-20

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018A030310666, 2019A1515111026,2020A1515010691）；廣東省教育廳項(xiàng)目（2017KCXTD016）

黎楚怡（1997－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。Email:1322990177@qq.com

杜曉東，男，教授。E-mail：gdhddxd@hotmail.com

（責(zé)任編輯：劉嶺）