呂亭亭，楊志華，謝 奇，葉翩翩，陶 娟，劉 旭*

(1.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)與中藥學(xué)院，江蘇 淮安 223005；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381)

泡桐(Paulowniafortunei)，多年生落葉喬木，是玄參科泡桐屬的簡稱。我國泡桐資源豐富，種類繁多，在黃河流域被用作傳統(tǒng)醫(yī)藥數(shù)百年[1]。由于泡桐具有易繁殖、生長速度快、材質(zhì)較好的特點(diǎn)，已被許多國家引種栽培，主要應(yīng)用于生態(tài)綠化和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。泡桐不但具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而且具有重要的藥用價(jià)值，泡桐植物的根、花、葉、皮、果均可入藥，具有抗氧化[2]、抗菌[3-4]、抗病毒[5]等藥理活性。泡桐花(PaulowniaFlos)即為泡桐的花，主要含有黃酮類、苯丙素類、萜類、糖類等活性成分，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱、燥濕止痢、清肝明目之功效[6-7]。泡桐花總黃酮具有抗菌[8]、抗炎[9]、抗病毒[10-11]、抗氧化[12]、增強(qiáng)免疫力[13]等生物活性，受到人們的廣泛關(guān)注。目前，測(cè)定植物中總黃酮含量的方法主要有高效液相色譜法和比色法[14]，其中高效液相色譜法操作繁瑣，主要用于測(cè)定黃酮單體，不適于總黃酮的含量測(cè)定；而亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法和三氯化鋁比色法由于操作簡單、實(shí)用性強(qiáng)，在總黃酮含量測(cè)定中被廣泛使用[15-17]。

作者以蘆丁為對(duì)照品，通過比較亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系和三氯化鋁顯色體系對(duì)總黃酮的吸收特性，篩選泡桐花總黃酮含量測(cè)定的合適方法，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)該方法的顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，為泡桐花總黃酮含量測(cè)定方法的研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

泡桐花，購自河南蘭考中草藥市場(chǎng)，經(jīng)鑒定屬玄參科泡桐屬植物。用多功能粉碎機(jī)粉碎成300 目，備用。

蘆丁對(duì)照品(純度≥98%)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁等均為分析純，無錫亞盛化工有限公司。

BF-10型多功能粉碎機(jī)，河北本辰科技有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；BSA型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 溶液的制備

1.2.1 顯色試劑的配制

5%NaNO2溶液：稱取亞硝酸鈉2.5 g，溶于50 mL蒸餾水中。

10%Al(NO3)3溶液：稱取硝酸鋁5 g，溶于50 mL蒸餾水中。

1.0 mol·L-1NaOH溶液：稱取氫氧化鈉4.0 g，溶于100 mL蒸餾水中。

0.1 mol·L-1AlCl3溶液：稱取三氯化鋁1.34 g，溶于100 mL蒸餾水中。

1.2.2 對(duì)照溶液的配制

取蘆丁對(duì)照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，定容至刻度，即得200 μg·mL-1對(duì)照溶液。

1.2.3 供試溶液的制備

稱取泡桐花粉末2.0 g，置于圓底燒瓶中，加入60%乙醇50 mL，90 ℃加熱回流提取2.0 h，冷卻，補(bǔ)重，離心，取20 mL上清液，用60%乙醇稀釋至50 mL，即得供試溶液。

1.3 泡桐花總黃酮含量測(cè)定方法的篩選

1.3.1 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[18-19]

精密量取供試溶液1.00 mL和對(duì)照溶液2.00 mL，分別置于燒杯中；各加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；再各加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；最后各加3.0 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液，用蒸餾水定容至10 mL，靜置15 min；以空白試劑作為參比，用紫外可見分光光度計(jì)在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描吸收曲線。

1.3.2 三氯化鋁比色法[20]

精密量取供試溶液1.00 mL和對(duì)照溶液2.00 mL，分別置于燒杯中；各加入2.0 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液，用蒸餾水定容至10 mL，靜置30 min；以空白試劑作為參比，用紫外可見分光光度計(jì)在300～500 nm波長范圍內(nèi)掃描吸收曲線。

1.4 顯色時(shí)間的優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)[16,19,21]

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種顯色試劑NaNO2、Al(NO3)3、NaOH的加入比例約為1∶1∶10。所以，測(cè)定泡桐花總黃酮含量時(shí)只要控制好3種顯色試劑的加入比例即可，試劑的加入量對(duì)吸光度的影響不大。為此，只需考察3種顯色試劑的靜置時(shí)間(顯色時(shí)間)對(duì)吸光度的影響。量取2 mL供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定泡桐花總黃酮含量，考察NaNO2顯色時(shí)間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)、Al(NO3)3顯色時(shí)間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)、NaOH顯色時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)對(duì)吸光度的影響。

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取NaNO2顯色時(shí)間(A)、Al(NO3)3顯色時(shí)間(B)、NaOH顯色時(shí)間(C)作為考察因素，以泡桐花總黃酮含量為考核指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化泡桐花總黃酮含量的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 泡桐花總黃酮含量測(cè)定方法的確定

分別采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系和三氯化鋁顯色體系對(duì)供試溶液和對(duì)照溶液進(jìn)行顯色，用紫外可見分光光度計(jì)在一定波長范圍內(nèi)掃描吸收曲線，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可知，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，對(duì)照溶液和供試溶液的吸收峰幾乎重合，最大吸收波長為500 nm；采用三氯化鋁顯色體系，對(duì)照溶液和供試溶液的最大吸收波長差異較大。因此，選擇亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定泡桐花總黃酮含量，檢測(cè)波長為500 nm。

圖1 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系(a)和三氯化鋁顯色體系(b)的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of solutions colored by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH chromogenic system(a) and AlCl3 chromogenic system(b)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

精密量取對(duì)照溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處吸光度，以蘆丁溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，擬合得線性方程為y=9.315x-0.0353，R2=0.9998。表明蘆丁濃度在0.02～0.10 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖2 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

2.2.2 重復(fù)性

分別稱取6份泡桐花樣品各2.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。計(jì)算泡桐花總黃酮含量分別為3.66%、3.71%、3.76%、3.64%、3.68%、3.72%，平均含量為3.70%，RSD為1.08%，小于3.0%，表明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度

稱取泡桐花樣品2.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。計(jì)算泡桐花總黃酮含量分別為3.52%、3.63%、3.67%、3.53%、3.64%、3.66%，平均含量為3.61%，RSD為1.67%，小于3.0%，表明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性

稱取泡桐花樣品2.0 g，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，分別在0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min取樣，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值，分別為0.528 0、0.527 2、0.526 8、0.526 1、0.521 2、0.518 1、0.512 0。表明泡桐花樣品溶液采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系顯色后吸光度在0～30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 準(zhǔn)確度

分別稱取6份泡桐花樣品各2.0 g，分別加入0.076 2 g蘆丁對(duì)照品，按1.2.3方法制備供試溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算泡桐花總黃酮的加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果見表2。

從表2可知，泡桐花總黃酮的加標(biāo)回收率在99.2%～105.5%之間，RSD為2.18%，小于3.0%，表明亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法準(zhǔn)確度良好。

表2 泡桐花總黃酮的加標(biāo)回收率

2.3 顯色時(shí)間優(yōu)化

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定泡桐花總黃酮，3種顯色試劑的顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響見表3。

表3 3種顯色試劑的顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

從表3可知，加入不同顯色試劑后，隨著顯色時(shí)間的延長，吸光度均逐漸減小并趨于穩(wěn)定。在加入顯色試劑NaNO2、Al(NO3)3、NaOH后，分別靜置6 min、6 min、15 min后吸光度穩(wěn)定。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以6 min、6 min、15 min為NaNO2顯色時(shí)間(A)、Al(NO3)3顯色時(shí)間(B)、NaOH顯色時(shí)間(C)的中心點(diǎn)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法顯色條件，結(jié)果與分析見表4。

從表4可知，因素A對(duì)總黃酮含量影響最大，其次是因素B，影響最小的是因素C；測(cè)定泡桐花總黃酮含量的最佳顯色條件為A2B2C1，即NaNO2顯色時(shí)間6 min、Al(NO3)3顯色時(shí)間6 min、NaOH顯色時(shí)間10 min。

2.4 泡桐花總黃酮含量的測(cè)定

分別稱取6份泡桐花樣品各2.0 g，按1.2.3方法制備樣品溶液，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系在優(yōu)化條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算泡桐花總黃酮的平均含量為3.78%，RSD為2.05%。說明該方法測(cè)定泡桐花總黃酮穩(wěn)定可行。優(yōu)化的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法簡便、快速、準(zhǔn)確，可作為泡桐花總黃酮含量的測(cè)定方法。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定泡桐花總黃酮較為合適，該方法的重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均較好，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等3種顯色試劑的最佳顯色時(shí)間分別為6 min、6 min、10 min，在此條件下測(cè)定的泡桐花總黃酮平均含量為3.78%，RSD為2.05%。