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        環(huán)核苷酸磷酸二酯酶PDE9A的體外表達(dá)、純化與酶活特性分析

        2020-10-27 08:42:10王郅媛李赤霞王友升
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        王郅媛, 李赤霞, 張 萌, 王友升,4,*

        (1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心/輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京 100048;2.北京科學(xué)儀器裝備協(xié)作服務(wù)中心, 北京 100048;3.山東凱普菲特生物科技有限公司, 山東 日照 276800;4.日照華偉大健康產(chǎn)業(yè)研究院, 山東 日照 276800)

        隨著人們對(duì)健康食品的關(guān)注日益增加,篩選食品功能因子成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[1-2]?;诎悬c(diǎn)導(dǎo)向的特定生物活性篩選是高通量開(kāi)發(fā)食品功能因子的較為廣泛的研究方法[3-4]。研究表明,環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)9A能催化體內(nèi)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)的水解[5],可作為篩選開(kāi)發(fā)具有有效預(yù)防糖尿病[6]、心血管病[7]、貧血[8]及阿爾茨海默氏癥[9-11]等功效的功能因子的新型靶點(diǎn)[12]?;赑DE9A靶點(diǎn)導(dǎo)向的生物活性物質(zhì)高通量篩選的前提是獲得高質(zhì)量的PDE9A蛋白并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)分析,但目前關(guān)于PDE9A體外表達(dá)及其酶學(xué)特性的報(bào)道較少。

        研究將人源PDE9A(氨基酸殘基181~506)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,利用異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)PDE9A蛋白表達(dá),采用不同純化系統(tǒng)制備高純度PDE9A,并對(duì)純化的PDE9A蛋白進(jìn)行酶活特性分析,以期可高通量篩選具有調(diào)節(jié)血糖等功能的天然活性物質(zhì),并為功能性食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1菌體與質(zhì)粒

        Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞BL21,本實(shí)驗(yàn)室保存;pET15b-PDE9A(氨基酸殘基181~506),美國(guó)北卡萊羅納大學(xué)教堂山分校柯衡明教授饋贈(zèng)。

        1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

        DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品Marker、10 x PCR buffer、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker,美國(guó)Thermo公司;乙二胺四乙酸鈉(EDTA),北京西隴化工有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base)、 氨芐青霉素(ampicillin,AMP)、氯霉素,美國(guó)Sigma公司;IPTG、cGMP,美國(guó)Amoresco公司;蛋白胨、酵母浸粉,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;氯化鈉,國(guó)藥集團(tuán);瓊脂,北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器

        French Press SL-650D型超聲破碎儀,南京順流儀器公司;層析實(shí)驗(yàn)冷柜,北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;JP61M/HV-85型高壓滅菌鍋,日本Hirayama公司;PHS-3D型pH計(jì),上海儀表有限公司;Thermo Forma ClassⅡA2型凈化工作臺(tái),美國(guó)Thermo公司;5810R型高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;1260型高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司。

        1.2.2蛋白純化柱

        30230型Ni-NTA agarose,德國(guó)Qiagen公司;17-0510-01型Q-SepharoseTMFast Flow、SephacrylTMS300,美國(guó)GE Healthcare Life公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1重組pET15b-PDE9A質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

        將pET15b-PDE9A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中37 ℃培養(yǎng)12~16 h。挑菌、接種到2xYT培養(yǎng)基中采用 IPTG低溫(15 ℃)誘導(dǎo)表達(dá)[13]。誘導(dǎo)結(jié)束后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min集菌,并分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)結(jié)束后測(cè)定600 nm處的吸光度,按照等菌體量取樣并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

        1.3.2PDE9A蛋白純化

        1.3.2.1 菌體破碎

        參考文獻(xiàn)[14],表達(dá)菌體按照質(zhì)量比1∶10加入提取液懸浮液并進(jìn)行超聲破碎(工作時(shí)間5 s,間歇時(shí)間5 s,共工作30 min)3次,分別對(duì)總蛋白質(zhì)、上清液蛋白、沉淀蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)[15]。

        1.3.2.2 基于重組蛋白多重性質(zhì)的分離純化

        上清液蛋白利用Ni-NAT瓊脂糖樹(shù)脂親和柱純化并在280 nm處測(cè)定純化蛋白質(zhì)的吸光度,將A280等于1定義為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度1 mg/mL,并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)[16]。Ni-NAT純化收集溶液中加入牛凝血酶酶切1.5 h。10 000 r/min離心20 min后,將上清液蛋白溶液加入Q-Sepharose進(jìn)行分離純化和SDS-PAGE檢測(cè)。Q-Sepharose純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)超濾濃縮至10 mL[17]。濃縮后的蛋白質(zhì)加入Sephacryl S300中進(jìn)行純化,洗脫收集的PDE9A蛋白測(cè)定其280 nm處的吸光度并進(jìn)行SDS-PAGE和Native-PAGE檢測(cè)。將蛋白收集液超濾濃縮至10 mg/mL以上并冷凍保存[18]。

        1.3.3PDE9A酶活力測(cè)定

        PDE9A酶活測(cè)定參考Hou等[19]。反應(yīng)體系為20 μmol/L cGMP底物、3.2 μg/mL PDE9A純化蛋白和20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.0),30 ℃反應(yīng)30 min后采用HPLC測(cè)定底物的含量,根據(jù)底物峰面積的減少量計(jì)算PDE9A蛋白的水解率。1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol cGMP所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U),相對(duì)酶活力定義為各條件測(cè)得的蛋白水解率相對(duì)于最高水解率的百分比。每組實(shí)驗(yàn)做3次平行實(shí)驗(yàn)。

        色譜檢測(cè)條件:色譜柱Intertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相A為0.02 mol/L KH2PO4,流動(dòng)相B為甲醇,洗脫條件為體積分?jǐn)?shù)82%A:18%B。檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL[20]。

        1.3.4最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

        按照1.3.3中的反應(yīng)條件,分別在4、25、30、37、45、50、60、70 ℃下反應(yīng)30 min后,測(cè)定其酶活力[21]。

        1.3.5最適pH值的測(cè)定

        配置不同pH值的緩沖液作為反應(yīng)緩沖液(pH值為3.0、4.0、5.0的檸檬酸鹽緩沖液,pH值為6.0、7.0的磷酸鈉鹽緩沖液、pH值為8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液),緩沖液的濃度均為20 mmol/L。根據(jù)1.3.3的方法,在最適溫度下反應(yīng)30 min后測(cè)定PDE9A蛋白的酶活力[22]。

        1.3.6Mg2+離子和DTT對(duì)酶活力的影響

        在磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH值7.0)、Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L,pH值8.0)反應(yīng)體系中分別添加10 mmol/L Mg2+和(或)1 mmol/L DTT,在最適溫度下反應(yīng)30 min后測(cè)定PDE9A的酶活力。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        SDS-PAGE電泳圖應(yīng)用Image軟件進(jìn)行分析,酶活特性測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 pET15b- PDE9A質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)分析

        對(duì)誘導(dǎo)0 h和24 h的蛋白表達(dá)菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果如圖1。低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)可以減少包涵體的形成,促進(jìn)可溶性蛋白的表達(dá)并維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[23]。由圖1可知,IPTG低溫(15 ℃)誘導(dǎo)24 h后,出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶,蛋白質(zhì)條帶的大小與PDE9A目的蛋白(約41 kDa)相近,由此可說(shuō)明該誘導(dǎo)條件可增加PDE9A蛋白表達(dá)含量且平均1 L培養(yǎng)基可得到3.125 g外源表達(dá)菌體。

        M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker;1:誘導(dǎo)0 h;2:誘導(dǎo)24 h。圖1 PDE9A蛋白不同誘導(dǎo)時(shí)間的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of PDE9A protein at different induction time

        2.2 PDE9A蛋白的分離純化分析

        外源表達(dá)菌體破碎以及Ni-NAT、Q-Sepharose和Sephacryl S300分離純化結(jié)果見(jiàn)圖2。 從圖2(a)可以看出,經(jīng)過(guò)超聲破碎后,上清液中的目的蛋白含量遠(yuǎn)高于沉淀中目的蛋白含量,說(shuō)明此蛋白質(zhì)水溶性較強(qiáng),但仍形成少量的包涵體。經(jīng)過(guò)Ni-NAT親和層析純化后,PDE9A蛋白純度達(dá)到80%以上,說(shuō)明PDE9A蛋白與Ni-NAT有較強(qiáng)的結(jié)合能力且PDE9A蛋白能夠得到有效純化(圖2(b))。牛凝血酶可在1.5 h內(nèi)有效切除蛋白質(zhì)中的His-tag標(biāo)簽,且經(jīng)過(guò)Q-Sepharose純化目的蛋白的純度達(dá)95%(圖2(c))。濃縮蛋白加入Sephacryl S300進(jìn)行進(jìn)一步純化,此時(shí)雜合蛋白的含量小于5%,證明Sephacryl S300分子篩純化系統(tǒng)可以進(jìn)一步去除雜蛋白,提高蛋白質(zhì)的純度(圖2(d))。

        PDE9A經(jīng)過(guò)Sephacryl S300純化后繼續(xù)濃縮并檢測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。Native-PAGE結(jié)果顯示蛋白質(zhì)基本沒(méi)有凝聚現(xiàn)象,主蛋白質(zhì)條帶占80%以上,表明PDE9A蛋白在此分離純化條件不易形成多聚體且維持較好的生物學(xué)活性,具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性(圖2(e))。

        純化過(guò)程蛋白質(zhì)回收率結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,Q-Sepharos純化后蛋白質(zhì)的回收率為36%,而Sephacryl S300純化后蛋白質(zhì)回收率為25%,說(shuō)明Q-Sepharos純化過(guò)程中損失大量蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)Ni-NAT、Q-Sepharos和Sephacryl S300純化后,最終1 g表達(dá)菌體可純化獲得8.9 mg蛋白質(zhì),證明該誘導(dǎo)條件能夠獲得大量的目的蛋白,并能經(jīng)過(guò)多重純化手段得到高純度的蛋白質(zhì)。

        M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker;1:超聲破碎總蛋白;2:離心上清液蛋白;3:離心沉沉淀蛋白;N:Ni-NAT純化;E:酶切1.5 h;Q:Q-Sephacrose純化的蛋白質(zhì);S:Sephacryl S300純化的蛋白質(zhì);N1:取樣3 μL;N2:取樣10 μL。圖2 PDE9A蛋白的分離純化凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PDE9A protein after different purification

        2.3 PDE9A蛋白酶活性分析

        利用HPLC檢測(cè)體系測(cè)定不同質(zhì)量濃度PDE9A蛋白對(duì)cGMP的水解情況,見(jiàn)表2。由表2可知,3.6 μg/mL PDE9A蛋白的水解率達(dá)77.27%,且酶活力達(dá)到7.76 U,說(shuō)明低質(zhì)量濃度PDE9A蛋白可以水解cGMP,具有較高生物活性。Rui等[24]純化的PDE9A蛋白的EC50值為0.083 47 mg/mL,相比較而言,本實(shí)驗(yàn)表達(dá)以及純化的蛋白酶活性更強(qiáng)。3.2 μg/mL的PDE9A蛋白可水解65%底物,因此該質(zhì)量濃度可用于篩選具有PDE9A蛋白抑制作用的天然活性物質(zhì)。

        表1 PDE9A蛋白質(zhì)純化回收率

        表2 不同含量PDE9A對(duì)cGMP水解情況

        2.4 PDE9A蛋白最適反應(yīng)溫度分析

        PDE9A蛋白的最適反應(yīng)溫度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出,該酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃。30 ℃的相對(duì)酶活力為60%,45 ℃的相對(duì)酶活力為40%;而在低溫4 ℃、高溫50 ℃及以上相對(duì)酶活力降至20%以下。由此可以看出,PDE9A蛋白最適反應(yīng)溫度與人體正常溫度相同,且其在25~45 ℃有較為廣泛的作用溫度范圍,說(shuō)明獲得的PDE9A蛋白能夠適應(yīng)較為寬泛的反應(yīng)溫度。

        圖3 PDE9A最適反應(yīng)溫度的測(cè)定Fig.3 Detection of optimum reaction temperature for PDE9A

        2.5 PDE9A蛋白最適反應(yīng)pH值分析

        PDE9A蛋白在不同pH值反應(yīng)緩沖液中的相對(duì)酶活力結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出,該酶的最適反應(yīng)緩沖體系的pH值為7.0,在pH值6.0~9.0,相對(duì)酶活力均能達(dá)到50%以上。由此可知,獲得的PDE9A蛋白更適合在堿性緩沖體系中發(fā)揮作用,這可能與人體的堿性環(huán)境有關(guān),也證明該酶能夠在較寬泛的pH值范圍內(nèi)發(fā)揮作用。

        圖4 PDE9A最適反應(yīng)pH值的測(cè)定Fig.4 Detection of optimum reaction pH value for PDE9A

        圖5 Mg2+與DTT對(duì)PDE9A酶活力的影響Fig.5 Effects of magnesium ion and DTT on PDE9A enzyme activity

        2.6 Mg2+和DTT對(duì)酶活力的影響分析

        磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH值7.0)和Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L,pH值8.0)反應(yīng)體系中Mg2+和DTT對(duì)PDE9A蛋白活性的影響見(jiàn)圖5。DTT具有較強(qiáng)的還原能力和巰基激活能力,在Tris-HCl緩沖液反應(yīng)體系中可將PDE9A蛋白相對(duì)酶活性提高16.8%,說(shuō)明PDE9A蛋白中含有較多的半胱氨酸。金屬離子是影響酶活性的重要因素之一,F(xiàn)isher等[25]證明Mg2+、Mn2+和Ca2+均可提高PDE9A蛋白的酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Mg2+在Tris-HCl緩沖液中可將相對(duì)酶活力提高34.6%,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,但在磷酸鹽緩沖液中無(wú)作用。在Tris-HCl緩沖液體系中,Mg2+和DTT共同作用可將相對(duì)酶活力提高71.8%,說(shuō)明PDE9A具有一定的金屬離子依賴(lài)性且活性中心可能有半胱氨酸,另外反應(yīng)體系的緩沖液會(huì)影響Mg2+和DTT對(duì)蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)。

        3 結(jié) 論

        本研究通過(guò)IPTG誘導(dǎo),使PDE9A蛋白在大腸桿菌中大量異源表達(dá),1 L培養(yǎng)基可獲得3.125 g蛋白表達(dá)菌體。采用多種純化手段對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,1 g表達(dá)菌體可純化得到8.9 mg高純度蛋白質(zhì)。通過(guò)高效液相色譜技術(shù)檢測(cè),制備的PDE9A具有較高的催化活性。此外,Mg2+和DTT能夠顯著提高PDE9A活性,但反應(yīng)體系的緩沖液會(huì)影響Mg2+和DTT對(duì)蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)作用。本研究最終制備得到高純度、高催化活性的PDE9A蛋白,可作為篩選具有調(diào)節(jié)血糖等功效的天然活性物質(zhì)的靶點(diǎn)。

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