易國富， 張 健， 李 赫， 劉新旗,*, 尹利端

(1.北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術研究中心/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品與健康學院， 北京 100048; 2.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司， 山東 煙臺 264006)

人類三分之一的時間是在睡眠中度過的，睡眠是人體的一種主動過程，可以恢復精神和解除疲勞。充足的睡眠、均衡的飲食和適當?shù)倪\動，是國際社會公認的三項健康標準。目前全球有三分之一的人患有睡眠障礙[1]。據(jù)2019年3月21日“世界睡眠日”的報道，我國目前約有38.5%的人患有睡眠障礙，并且睡眠障礙人群中女性是男性的1.5～2.0倍，而40%～70%的老年人患有睡眠障礙[2]。中國已經(jīng)步入老齡化社會，研究報道老年人相較于年輕時候，其消化和吸收的蛋白酶下降了30%～50%[3-4]，而作為宏觀營養(yǎng)素的蛋白質(zhì)在人體承擔著各種生理活性的調(diào)節(jié)作用，其攝入不足容易引起人體“負氮平衡”，最終導致各種常見的老年人健康問題，如睡眠障礙、記憶力下降、肌肉萎縮、免疫力下降等[5-9]。

大豆蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其所含的必需氨基酸種類齊全、比例適當，經(jīng)過蛋白酶水解或微生物發(fā)酵，再經(jīng)過超濾膜分離和噴霧干燥等工藝處理得到肽的混合物，其平均分子質(zhì)量分布低于1 000 Da[10]。大豆肽(soybean peptides, SBP)相較于大豆蛋白和游離氨基酸，在提供氨基酸方面具有吸收速度快、載體不飽和、易溶于水、無抗原性、生物活性高等特點[11]。生物活性肽具有抗氧化、降血壓、減脂、免疫調(diào)節(jié)、降糖、抗癌等功能特性，是目前研究的一個熱點[12-13]。

自Morgan首創(chuàng)性地在遺傳學上研究果蠅[14]，如今，果蠅已成為遺傳學研究的新寵。與其他模式生物相比，果蠅易繁殖、操作便捷、生命周期短(25 ℃，40～60 d)，且果蠅的基因與人類的基因同源性高達80%[15]。果蠅在20 d以后，表現(xiàn)出老年人的睡眠特征[16]，因此，利用果蠅遺傳學的優(yōu)勢，在20 d時研究果蠅的睡眠對老年人睡眠具有重要的參考意義。果蠅睡眠的調(diào)控是通過生物鐘系統(tǒng)和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)協(xié)同作用完成的[17]。目前，研究報道了果蠅的十多個生物鐘基因，其中period(per)、timeless(tim)、clock(clk)、cycle(cyc)4個為核心的鐘基因[18]。調(diào)控睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)，主要有促進睡眠的γ-氨基丁酸(GABA)、五羥色胺(5-HT)，促進覺醒的谷氨酸(Glu)和組胺(His)[19-21]，以及果蠅腦內(nèi)GABA的限速酶——谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)、5-HT的限速酶——色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase，TPH)、Glu的限速酶——谷氨酸脫氫酶(glutamic dehydrogenase，GDH)、His的限速酶——組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)[22]。

本研究以果蠅為實驗模型，采用動物行為分析系統(tǒng)監(jiān)測SBP對20日齡雄性處女果蠅睡眠行為的影響，并檢測SBP對生物鐘基因(per、tim、clk、cyc)與參與調(diào)控睡眠神經(jīng)遞質(zhì)合成限速酶的基因(gad、tph、gdh、hdc)的影響，旨在探索SBP對老年果蠅睡眠營養(yǎng)干預的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，山東御馨生物科技有限公司；堿性蛋白酶(200 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)，上海源葉生物科技有限公司；野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)，北京大學生命科學學院；TRIzol試劑，美國Life Technologies公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，美國Progema公司；5-HT ELISA試劑盒，中國江萊生物；SYBR Green Mix PCR試劑盒，賽默飛世爾(中國)公司。

1.2 儀器與設備

人工氣候培養(yǎng)箱，德國Binder公司；VideoTrack動物行為分析系統(tǒng)，法國Viewpoint公司；Milli- Q Integral 5型純水儀，美國Millipore公司；Alpha1- 2LD型冷凍干燥機，德國Christ公司；LightCycler96型RT-qPCR儀，瑞士Roche公司；LC20A液相(色譜柱為TSK-GEL G2000SWXL，(7.8 mm×300 mm×5 μm))，日本Shimadzu公司；0.22 μm陶瓷微濾膜、2 000 Da超濾膜，江蘇久吾高科技股份有限公司；YXQ- LS- 75SⅡ型高壓滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；Infinite 200 Pro Nanoquant型酶標儀，瑞士Tecan公司。

1.3 實驗方法

1.3.1SBP的制備

配置w=2%大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)水溶液，按照4 000 U/g的加酶量添加酶，分別添加堿性蛋白酶和中性蛋白酶，反應溫度55 ℃、pH值為7、反應時間4 h。然后在溫度85 ℃的條件下滅活15 min，用陶瓷微濾膜和超濾膜過濾，在40 ℃、60 MPa條件下過濾，得到的濾液在-40 ℃、壓強12 Pa、時長30 h的條件下冷凍干燥，得到SBP。SBP的制備過程見圖1。

圖1 大豆肽的制備流程Fig.1 Preparation process of soybean peptides

1.3.2SBP分子量分布的測定

通過凝膠過濾色譜法在LC20A上進行測量。使用的色譜柱為TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.8 mm×5 μm)。制備的肽質(zhì)量濃度為1 mg/mL，所有用于測量分子量的標準品質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。進樣前，樣品和標準品均通過0.22 μm過濾器過濾。進樣量為20 μL，流動相V(水)∶V(乙腈)∶V(三氯乙酸)= 80∶20∶0.1，流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm。

1.3.3果蠅基礎培養(yǎng)基的配置

將培養(yǎng)瓶和指管清洗干凈，與橡膠塞一同放入滅菌鍋中滅菌，溫度120 ℃，時間30 min。冷卻后在紫外燈下照射30 min。在5 L的電飯煲中首先加入蒸餾水1.65 L，加入蔗糖31.62 g、葡萄糖63.24 g、酵母32.19 g、瓊脂10.6 g，并不斷攪拌升溫煮沸，加入玉米粉77.7 g，再煮15～20 min，保溫15 min(保溫13 min時加入山梨酸鉀2 g，無水氯化鈣0.726 g)，充分攪勻，并將其通過食物注入槍注入指管中，每個指管裝6.5 mL，在紫外燈下照射30 min；注入培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶25 mL，在紫外燈下照射30 min。然后蓋上橡膠塞，并放在4 ℃的冰箱中待用[23]。

1.3.4果蠅的睡眠監(jiān)控

取20日齡雄性果蠅在二氧化碳麻醉臺上麻醉后，分為4組，每組32只，其中一組為空白組，另外3組添加2、4、8 mg/mL的大豆低聚肽。劑量設定是根據(jù)成年人體重70 kg的每日蛋白質(zhì)需求是60～70 g粗蛋白，作為優(yōu)質(zhì)蛋白源營養(yǎng)補充約每日需要10 g/d的量，優(yōu)質(zhì)蛋白補充系數(shù)為1/7[10]。培養(yǎng)基配方中蛋白質(zhì)的含量約為29 mg/mL，故大豆低聚肽作為優(yōu)質(zhì)蛋白源添加到培養(yǎng)基的量為4 mg/mL的劑量，在4 mg/mL的基礎上試驗添加了2 mg/mL和8 mg/mL濃度梯度進行研究[24-25]，分別為高劑量組(8 mg/mL)、中劑量組(4 mg/mL)、低劑量組(2 mg/mL)。每個監(jiān)測管中裝1只果蠅，一端塞上能透氣的海綿，另一端附上0.5 cm的培養(yǎng)基或額外添加SBP的培養(yǎng)基并用蠟封以防止失水風干。采用動物行為分析系統(tǒng)VideoTrack，在12/12 h明暗的條件下監(jiān)測果蠅睡眠，20日齡21:00放入檢測管中，先讓果蠅適應12 h，分析數(shù)據(jù)從第21日9:00至第26日9:00的睡眠數(shù)據(jù)，把監(jiān)測玻璃管固定到檢測板上，每5 min記錄一次數(shù)據(jù)，如圖2。

圖2 果蠅在動物行為分析系統(tǒng)中的睡眠監(jiān)控圖Fig.2 Drosophila sleep monitoring chart in animal behavior analysis system

1.3.5果蠅頭部取樣

選取日齡20日雄性果蠅，在當日21:00，在培養(yǎng)基中(共4個組：空白組和SBP的3個劑量組，每組50只)培養(yǎng)48 h后，即22日晚上21:00，取待測果蠅通過二氧化碳麻醉，并裝在凍存管，迅速放入液氮罐中，5 min后取出迅速用力搖晃，使其充分破碎，倒入40目的實驗室標準篩(篩子提前用液氮冷卻)，篩子截留的就是果蠅的軀體，篩子下方放白紙，白紙上面就是果蠅的頭、腿、翅、觸角，再將白紙上的樣品倒入20目的篩子，篩子截留果蠅的頭部。將果蠅頭部置于凍存管中，放入液氮備用。

1.3.6果蠅頭部RNA提取和RT-qPCR測量

將收集的果蠅頭部樣品每組30只，使用液氮研磨，加入TRIzol試劑裂解樣品并根據(jù)試劑盒說明書提取果蠅頭部總RNA。將RNA樣品1 μg用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進一步使用SYBR Green Mix試劑盒進行熒光定量PCR，使用RT-qPCR儀檢測目的基因mRNA表達水平。RT-qPCR反應程序為：95 ℃下預變性10 min(1個循環(huán))，在95 ℃下10 s，60 ℃下1 min條件下進行40個循環(huán)擴增，收集Ct值數(shù)據(jù)后采用2^-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析[26]，使用GAPDH基因作為內(nèi)參。表1為檢測使用的引物信息[27]。

表1 果蠅基因引物序列Tab.1 Drosophila gene primer sequences

1.3.7果蠅頭部5-HT的測量

從液氮罐中取出裝有果蠅頭的凍存管，每組30只，加入0.5 mL的生理鹽水，勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，使用5-HT ELISA試劑盒，每組3個平行，在酶標儀450 nm的波長下測量。

1.4 統(tǒng)計分析方法

所有實驗重復3次，結(jié)果表示為平均值±標準偏差。使用SPSS 16軟件通過單向方差分析所有數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學分析時，認為P<0.05為顯著差異，P<0.01為較顯著差異，P<0.001為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBP的分子量分布

與空白組比較，*表示顯著差異P<0.05，**表示較顯著差異P<0.01。圖3 大豆肽對果蠅睡眠時長的影響Fig.3 Effect of soybean peptides on sleep duration of Drosophila

通過凝膠過濾色譜法測定SBP的分子量分布。見表2，觀察到分子量186～1 000 Da的比例為84.58%，平均分子量約為722.37 Da，由約2～5個氨基酸組成。

表2 大豆肽的分子質(zhì)量分布Tab.2 Molecular weight distribution of soybean peptides

2.2 SBP對果蠅睡眠時長的影響

以沒有添加SBP的培養(yǎng)基喂養(yǎng)的果蠅為空白組，在空白組中額外加入SBP(2、4、8 mg/mL)，研究對雄性果蠅睡眠時長的影響，見圖3。由圖3a可知，與空白組相比，SBP的3個劑量組均能延長果蠅白天的睡眠時長且隨劑量的升高而升延長，呈現(xiàn)濃度依賴性，尤其是高劑量組延長效果最好，但3個劑量組相對于空白組都無顯著性差異。由圖3b可知，與空白組相比，第2天，SBP的低、中、高三個劑量組均能顯著(P<0.05)提高睡眠時長，中劑量、高劑量能較顯著(P<0.01)提高睡眠時長。在第1天、第3天高劑量顯著(P<0.05)提高睡眠時長。由圖3c可知，果蠅全天睡眠的分析中，與空白組相比，SBP的低劑量和中劑量組顯著(P<0.05)延長果蠅的睡眠時長，高劑量組較顯著(P<0.01)延長了果蠅的睡眠時長，第3天高劑量組顯著(P<0.05)延長了果蠅的睡眠時長。

在添加SBP之后的前3天中，第2天效果最顯著能延長睡眠時長，隨著時間的延長，到了第4天、第5天SBP不再延長果蠅的睡眠時長，這可能是由于SBP在潮濕的環(huán)境下已經(jīng)變質(zhì)，有文獻報道肽類物質(zhì)相較于蛋白質(zhì)和氨基酸更易被微生物利用[28]。因此，在20日額外添加SBP，睡眠時長延長，最佳時效是48～60 h，最佳劑量為8 mg/mL。

2.3 SBP對果蠅生物鐘基因的營養(yǎng)調(diào)節(jié)

果蠅的睡眠4個核心鐘基因(per、tim、clk、cyc)和其他鐘基因及其編碼蛋白組成了互相轉(zhuǎn)錄- 翻譯反饋環(huán)路以驅(qū)動其晝夜節(jié)律，并且在果蠅和哺乳動物之間保持一致，見圖4[29]。圖4顯示，首先DNA結(jié)合異二聚體CLK/CYC(clk和cyc轉(zhuǎn)錄而來)與靶標啟動子中的E-box序列(通常為CACGTG)結(jié)合以激活基因per/tim，并轉(zhuǎn)錄表達形成PER/TIM蛋白二聚體，在傍晚光線消失后開始大量轉(zhuǎn)錄形成，到午夜的時候，達到頂峰，隨后，PER/TIM蛋白二聚體，慢慢解離，并進入細胞核中，通過CK2、SGG、PP2A、PP1，調(diào)節(jié)形成PER和TIM的磷酸化并與DBT結(jié)合抑制DNA結(jié)合CLK/CYC，并與靶標啟動子中的E-box序列結(jié)合，抑制激活per/tim基因的轉(zhuǎn)錄。抑制CLK/CYC轉(zhuǎn)錄激活(白天)和抑制PER/TIM(夜晚)，完成整個晝夜的睡眠/覺醒的調(diào)節(jié)循環(huán)[29]。

圖4 cyc/clk和per/tim的調(diào)節(jié)反饋回路圖Fig.4 Feedback loop of cyc/clk and per/tim

SBP對果蠅睡眠調(diào)控生物基因的影響見圖5，SBP的3個劑量組均顯著上調(diào)per、tim、clk、cyc基因的表達水平。SBP的中劑量組對果蠅的4個核心鐘基因均較顯著上調(diào)(P<0.01)，低劑量組只對tim基因較顯著上調(diào)(P<0.01)，對per、clk、cyc這3個基因只是顯著上調(diào)；相較于空白組，果蠅睡眠基因的影響尤其是tim基因上調(diào)效果最好，低劑量和中劑量SBP均較顯著上調(diào)(P< 0.01)，尤其是高劑量SBP極顯著上調(diào)了tim基因(P<0.001)。這說明SBP的攝入可能對果蠅的tim基因影響更敏感，從而促進PER/TIM蛋白二聚體的形成，以延長睡眠時長。

與空白組比較，*表示顯著差異P<0.05，**表示較顯著差異P<0.01，***表示極顯著差異P<0.001。圖5 大豆肽對果蠅睡眠調(diào)控生物基因的影響Fig.5 Effect of soybean peptides on sleep-regulating biological genes of Drosophila

2.4 SBP對果蠅睡眠調(diào)控相關神經(jīng)遞質(zhì)合成基因的營養(yǎng)調(diào)節(jié)

SBP對果蠅睡眠調(diào)控相關神經(jīng)遞質(zhì)合成基因的影響見圖6，相較于空白組，SBP的高劑量組對gdh和hdc的基因表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，對gad的基因表達水平較顯著上調(diào)(P<0.01)，對tph的基因表達水平極顯著上調(diào)(P<0.001)。

與空白組比較，*表示顯著差異P<0.05，**表示較顯著差異P<0.01，***表示極顯著差異P<0.001。圖6 大豆肽對果蠅睡眠調(diào)控相關神經(jīng)遞質(zhì) 合成基因的影響Fig.6 Effect of soybean peptides on sleep regulation-related neurotransmitter synthesis genes of Drosophila

大豆肽對果蠅腦部五羥色胺含量的影響見圖7，SBP的中劑量組對gad和gdh均顯著上調(diào)(P<0.05)，tph較顯著(P<0.01)上調(diào)，而對hdc的影響無統(tǒng)計學意義。SBP的低劑量組只對tph基因上調(diào)較顯著(P<0.01)，其他3個基因影響無差異，結(jié)合圖3b，第2天晚上SBP的低劑量組是顯著性促進果蠅睡眠延的。因此，SBP對果蠅睡眠延長是通過上調(diào)tph基因的表達完成的。因此，為了進一步驗證，測量了tph調(diào)節(jié)相關的神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺的含量。由圖7可知，相較于空白組，SBP高劑量組對果蠅的5-HT含量顯著性升高(P<0.05)，而低劑量和中劑量組對五羥色胺含量都有升高。SBP在對小鼠睡眠延長實驗中，促進了五羥色胺的分泌并顯著提高了小鼠的褪黑素含量導致小鼠睡眠延長[30]，這與SBP對果蠅睡眠延長影響一致，又據(jù)文獻報道，升高果蠅五羥色胺的含量可較大程度促進果蠅睡眠[31-32]。故而，SBP是通過上調(diào)果蠅腦內(nèi)5-HT的限速酶TPH表達，進而提高5-HT含量來促進果蠅睡眠。

3 結(jié) 論

在研究老年果蠅睡眠實驗中，研究發(fā)現(xiàn)SBP的3個劑量組(2、4、8 mg/mL)對其睡眠時長上調(diào)最佳的時間為第2日的晚上，即加入SBP后的48～60 h之間，最佳劑量8 mg/mL。通過核心鐘基因(per、tim、clk、cyc)的測定，得到響應最強的是tim基因，因此，SBP促進果蠅睡眠是上調(diào)了tim基因表達提高PER/TIM蛋白二聚體含量來促進果蠅夜晚睡眠的。SBP對果蠅腦中γ-氨基丁酸、五羥色胺、組胺和谷氨酸合酶基因gad、tph、gdh、hdc的表達水平的影響中，只有低劑量組顯著上調(diào)了tph基因表達，進而又測定了5-HT的含量，研究表明，SBP提高了果蠅腦內(nèi)5-HT的含量。因此SBP是通過上調(diào)tim基因，提高轉(zhuǎn)錄形成PER/TIM蛋白二聚體，進而上調(diào)TPH的酶活，增加5-HT的含量來延長果蠅的睡眠。后續(xù)將SBP對果蠅的睡眠影響機制進行更深入的研究，為SBP對睡眠的影響提供更多的科學依據(jù)。