陳 洋， 尚政軍

（湖北省口腔基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，武漢大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢430072）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）來源于口腔黏膜鱗狀分化的上皮細(xì)胞，是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，以高度局部浸潤性及易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為特征，其常規(guī)治療手段為手術(shù)切除并輔以放化療[1]。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體對細(xì)胞器及蛋白質(zhì)進(jìn)行降解的過程，以達(dá)到自我更新、維持穩(wěn)態(tài)的目的。根據(jù)溶酶體接受待降解物質(zhì)的不同方式，細(xì)胞自噬主要有3種形式：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。其中巨自噬最為常見，也是通常意義上的自噬，其特征為具有自噬體的形成[2]。越來越多的研究表明，細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞失去極性及細(xì)胞間黏附，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，其與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。然而，現(xiàn)階段關(guān)于自噬與EMT的關(guān)系在OSCC中尚不清楚。本研究嘗試探索其中的機制，為實現(xiàn)OSCC精準(zhǔn)靶向治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人OSCC細(xì)胞系CAL27購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；主要試劑：E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體購于美國CST公司；p62、Beclin1、波形蛋白（Vimentin）抗體、熒光二抗購于武漢三鷹公司。

1.2 饑餓處理

在培養(yǎng)皿上接種合適數(shù)量的OSCC細(xì)胞CAL27，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%左右時，更換完全培養(yǎng)基為漢克斯平衡鹽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為正常組，中途使用漢克斯平衡鹽溶液進(jìn)行換液處理的細(xì)胞為饑餓組。

1.3 Western印跡法

蛋白上樣量為30μg/孔。電泳：濃縮膠內(nèi)采用60 V，30 min；分離膠內(nèi)采用120 V，70 min。轉(zhuǎn)膜：采用恒流200 mA，90 min。室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST溶液漂洗，加入一抗于4℃下孵育過夜。第2天用TBST溶液洗3次，每次10 min。加入二抗置室溫下孵育1 h。TBST溶液洗3次，每次10 min。發(fā)光液孵育3 min后使用成像儀成像。

1.4 細(xì)胞免疫熒光實驗

棄去原有培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗3次，多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次，加入3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）置室溫封閉1 h。加入一抗，4℃過夜孵育。PBS洗3次，加入熒光二抗，37℃孵育30 min。PBS洗3次，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色1 min。PBS洗3次后于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 饑餓后CAL27細(xì)胞自噬水平增強

Western印跡法結(jié)果顯示，使用漢克斯平衡鹽溶液培養(yǎng)CAL27細(xì)胞6 h后，與未進(jìn)行饑餓處理的細(xì)胞相比，饑餓組細(xì)胞中p62的表達(dá)降低，Beclin1的表達(dá)增高（圖1），表示饑餓組自噬水平增高。

2.2 自噬增強的CAL27細(xì)胞發(fā)生了EMT

為探討自噬對EMT的影響，對CAL27細(xì)胞進(jìn)行EMT相關(guān)指標(biāo)的檢測。結(jié)果顯示，自噬增強后，其E-鈣黏蛋白下降，N-鈣黏蛋白及波形蛋白表達(dá)升高（圖2），且細(xì)胞形態(tài)變成紡錘樣間質(zhì)細(xì)胞（圖3）。結(jié)果證明CAL27細(xì)胞在自噬增強后發(fā)生了EMT。

圖1饑餓6 h后，Western印跡法顯示CAL27細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin及p62水平的變化Figure 1 Western blot analysis of expression of Beclin 1 and p62 of autophagy in CAL27 cells after starvation for 6 h

圖2饑餓6 h后，CAL27細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)的變化Figure 2 The changes of EMT-related markers of CAL27 cells after starvation for 6 h

圖3饑餓6 h后，CAL27細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變（×200）Figure 3 The change of morphology of CAL27 cells after starvation for 6 h(×200)

3 討論

OSCC是全世界排名第8的惡性腫瘤[5]。盡管近年來OSCC在診斷和治療策略等方面取得了巨大進(jìn)展，但由于其易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者的總體5年生存率僅為50%左右[6]。細(xì)胞自噬指部分需要降解的細(xì)胞內(nèi)容物被運送到溶酶體進(jìn)行消化的過程，其主要功能是提供細(xì)胞存活需要的能量，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，實現(xiàn)細(xì)胞的自我更新[2]。細(xì)胞自噬受到一系列自噬相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，在饑餓及其他應(yīng)激條件下，Bcl-2與Beclin1相互解離后，將自噬活化信號向下傳遞，導(dǎo)致微管相關(guān)蛋白輕鏈3與p62/SQSTM1聚合物結(jié)合，促進(jìn)自噬小體的形成和待降解物質(zhì)的降解，此過程表現(xiàn)為Beclin1的升高及p62的降低[7]。細(xì)胞自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著不同的甚至是自相矛盾的角色[8]。在腫瘤發(fā)生的早期，細(xì)胞自噬可以抑制腫瘤的發(fā)生，抑制細(xì)胞自噬能夠促進(jìn)腫瘤的增長[9]。但是，在腫瘤的進(jìn)展過程中，細(xì)胞自噬可以增強腫瘤細(xì)胞的放化療抵抗能力，維持腫瘤細(xì)胞的氧化代謝活動，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。

EMT過程中上皮細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間黏附性降低，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧忓N樣間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強。此外，EMT相關(guān)分子的表達(dá)也會發(fā)生變化，表現(xiàn)為E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)增高[11]。研究證明，EMT與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。

細(xì)胞自噬參與了EMT并具有促進(jìn)和抑制EMT的雙重作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Beclin1的減少能引起自噬抑制，可以活化胃癌細(xì)胞中的低氧誘導(dǎo)因子-1a（hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a），誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)AEG-1基因可以誘導(dǎo)自噬的持續(xù)激活，使肝癌細(xì)胞TGF-β1自分泌水平上調(diào)，并通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad3信號通路促進(jìn)肝 癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[15]。

但目前為止，細(xì)胞自噬與EMT在OSCC中的相關(guān)機制尚不清楚。本研究饑餓誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞發(fā)生自噬，Western印跡法證明其自噬水平增高。隨后利用Western印跡法和免疫熒光技術(shù)檢測其EMT相關(guān)指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)CAL27細(xì)胞發(fā)生自噬后，其E-鈣黏蛋白表達(dá)量降低，N-鈣黏蛋白和波形蛋白表達(dá)量增高，且細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N樣間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。由此推斷，自噬的激活可以促進(jìn)OSCC細(xì)胞發(fā)生EMT，使用特異性自噬抑制劑可以阻止腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，這為OSCC的臨床治療提供了新的思路。