謝玉霞 姜海兵 楊 潔 張 靜 梁 鋮 劉文寧

冠心病作為嚴重危害人類健康的疾病之一，近年來的發(fā)病逐漸趨于年輕化，且病死率一直居高不下[1，2]。冠心病的發(fā)病以動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化引發(fā)心肌細胞的損傷，推進冠心病的病理進程，緩解心肌細胞的損傷亦是臨床上控制冠心病的重要環(huán)節(jié)之一[3,4]。因此，發(fā)現(xiàn)更多能夠有效控制心肌細胞損傷的藥物至關(guān)重要。ATP敏感性鉀離子通道是位于心臟和血管平滑肌上且能夠被細胞內(nèi)ATP和其他腺嘌呤核苷酸抑制的內(nèi)向整流 K+通道，其中線粒體 ATP 敏感性鉀離子通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP)廣泛的存在于線粒體內(nèi)膜上，當細胞內(nèi) ATP 消耗降低時，該通道開放，促進線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[5,6]。二氮嗪作為mitoK-ATP開放劑已經(jīng)被證明具有對抗心肌損傷的作用，但其對心肌細胞的作用機制研究尚不完善。本研究旨在探討二氮嗪對冠心病大鼠心肌細胞影響及機制，為臨床研究提供幫助[7,8]。

材料與方法

1.材料: 健康清潔級SD大鼠，50只，體質(zhì)量150±20g[新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,實驗動物許可證號：SCXK(新)2018-0011]；高脂飼料(南京卡文斯生物技術(shù)有限公司)；垂體后葉素(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司)；苯妥英鈉(南京谷歌生物技術(shù)有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6檢測試劑盒(福麥斯生物技術(shù)有限公司)； 原位缺口末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)凋亡檢測試劑盒(北京素萊寶科技有限公司)；Kir6.2、ERK1/2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體，山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；電泳儀(南京大學儀器廠)；微型垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

2.冠心病大鼠造模: 50只大鼠隨機分為5組，分別為對照組、模型組、二氮嗪低、中、高劑量組；除對照組外，其余各組大鼠高脂飲食6周后腹腔注射垂體后葉素(30μg/kg)，1次/24h，共3次，構(gòu)建冠心病大鼠模型；造模后給藥治療14天，二氮嗪低、中、高劑量組給藥劑量分別為3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg，每天灌胃給藥1次，對照組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液。

3.Elisa檢測血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平: 實驗結(jié)束后，腹腔注射 50mg/kg 苯妥英鈉麻醉大鼠，腹主動脈取5ml全血，室溫靜置4h后，3500r/min，4℃離心15min，分離上層血清，按照Elisa試劑盒檢測方法，主要步驟為鋪好一抗的96孔板內(nèi)加入40μl待測樣品和10μl生物素標記抗體后，加入100μl辣根過氧化物酶標記抗體，37℃孵育75min，清洗96孔板后加入顯色劑顯色，終止后于酶標儀450nm處測吸光度，根據(jù)標準曲線計算血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

4.HE染色檢測心肌組織病理變化: 給藥結(jié)束后，腹腔注射50mg/kg苯妥英鈉麻醉大鼠，摘除大鼠心臟并將其置于冰上，用醫(yī)用紗布包裹輕輕按壓排凈心臟內(nèi)血液，并在距心尖2mm 處沿橫向?qū)⑵淝虚_，取寬約 2mm 的心臟組織放于組織固定液中固定72h，其余部分于-80℃保存。固定后將組織用梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋后制成組織切片，然后將石蠟切片進行透明水化，HE染色、封片后于顯微鏡下拍照，觀察組織病理變化。

5.TUNEL檢測大鼠心肌細胞凋亡: 將制備好的石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯及各梯度乙醇脫蠟至水，蒸餾水水化5min，用0.1mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中進行熱修復，分別經(jīng)過3%H2O2甲醇液、0.1%TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反應混合液、過氧化物酶(peroxidase, POD) 轉(zhuǎn)化劑孵育及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)沖洗后，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB) 溶液顯色，并在顯微鏡下觀察，終止后用邁耶蘇木精染核，PBS 沖洗后，甘油封片劑封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。

6.Western blot法檢測心肌組織Kir6.2和caspase-3的表達水平: 取各組大鼠心臟組織約 60mg于10ml EP管中，加入500μl RIPA 蛋白裂解液及5μl的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，于組織勻漿機中勻漿均勻，然后將各組樣品 4℃低溫下裂解 30min后置于 4℃離心機中12000r/min離心10min并取上清液，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量法檢測總蛋白的含量。進行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate, SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)對PVDF膜封閉2h，然后以稀釋后的GAPDH、 Kir6.2和ERK1/2一抗4℃孵育過夜，洗膜后室溫孵育二抗1.5h，洗膜后將聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜浸入發(fā)光液，曝光并拍照，用Image J軟件曝光結(jié)果進行定量分析。

結(jié) 果

1. 血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6檢測結(jié)果: 與對照組比較，模型組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，二氮嗪低、中、高給藥組其血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低(P<0.05)，呈劑量依賴性(表1)。

2.HE染色結(jié)果: 對照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，心肌細胞排列整齊，細胞形態(tài)正常，未表現(xiàn)出明顯的病理損傷；模型組大鼠心肌結(jié)構(gòu)損傷嚴重，心肌細胞大面積壞死，心肌細胞水腫嚴重，有大量炎性細胞浸潤，表明造模成功；二氮嗪低劑量組，心肌細胞損傷較模型組有所緩解，炎性細胞浸潤有所減少，但仍存在顯著的病理損傷；二氮嗪中、高劑量組心肌組織損傷顯著緩解，病變部位局限，心肌細胞排列整齊，心肌水腫減弱，且呈劑量依賴性(圖1)。

表1 各組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6檢測結(jié)果比較

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×20)A.對照組；B.模型組；C.二氮嗪低劑量組；D.二氮嗪中劑量組；E.二氮嗪高劑量組

3.原位缺口末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)檢測大鼠心肌細胞凋亡結(jié)果: 與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)目顯著增多(P<0.05)，提示冠心病大鼠心肌細胞凋亡嚴重，從而造成心肌組織損傷；與模型組比較，二氮嗪低、中、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)目顯著減少(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2)。

4.Western blot法檢測Kir6.2和ERK1/2的表達：與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Kir6.2表達量增加(P<0.05)，提示可能是由于冠心病心肌細胞損傷引起Kir6.2表達代償性增高，其余各組Kir6.2表達量均顯著升高(P<0.05)，提示線粒體ATP敏感性鉀離子通道處于大量開放狀態(tài)；與模型組比較，二氮嗪低、中、高劑量組大鼠心肌組織Kir6.2表達量均顯著提高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。與對照組比較，模型組大鼠心肌組織ERK1/2表達量顯著增高(P<0.05)，與模型組比較，二氮嗪低、中、高劑量組ERK1/2表達量顯著減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性(圖3)。

圖3 各組大鼠心肌組織Kir6.2和ERK1/2表達水平A.Western blot法檢測結(jié)果；1.對照組；2.模型組；3.二氮嗪低劑量組；4.二氮嗪中劑量組；5.二氮嗪高劑量組;B.各組大鼠心肌組織蛋白相對表達量；與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

討 論

冠心病作為心血管疾病之一，一直是國內(nèi)外心血管方向研究的重點，心血管疾病大多發(fā)病機制復雜，治療困難，且患者預后較差。目前臨床治療冠心病的主要是通過手術(shù)和藥物治療，在藥物治療中，保護心肌細胞，阻止其進一步損傷是重要的環(huán)節(jié)[9]。有研究表明，心肌細胞特有的ATP敏感性鉀離子通道的開放對心肌細胞有顯著的保護作用，主要表現(xiàn)在線粒體內(nèi)膜上的ATP敏感性鉀離子通道開放可以促進線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能，二氮嗪作為高選擇性線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑，低劑量即可有效誘導其開放[10～12]。本研究通過構(gòu)建冠心病大鼠模型，探究了二氮嗪對冠心病大鼠心肌組織細胞的影響及機制。

炎性反應貫穿冠心病發(fā)生發(fā)展的全過程，已有研究表明，冠心病患者血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的升高導致動脈斑形成加速、血栓形成加速、血管通透性增加等病理現(xiàn)象，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子亦可作為動脈粥樣硬化的治療靶點[13]。本研究結(jié)果顯示，二氮嗪能夠顯著降低冠心病大鼠血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，提示二氮嗪具有能夠顯著抑制炎性反應的作用。

細胞凋亡是指細胞內(nèi)部一系列基因調(diào)控的改變而引起的細胞程序性死亡，已有研究表明，動脈粥樣硬化、冠心病、心律失常等心血管疾病均與心肌細胞的凋亡有關(guān)[14～16]；在細胞早期凋亡的過程中會消耗大量的ATP，引起細胞能量代謝不足而大面積凋亡，二氮嗪作為線粒體ATP依賴性鉀離子通道開放劑能夠增加線粒體產(chǎn)能為細胞提供能量，緩解細胞的凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示，二氮嗪能夠顯著抑制冠心病大鼠心肌細胞的凋亡，且呈劑量依賴性，提示二氮嗪或可通過抑制細胞凋亡而緩解冠心病的進程。

Kir6.2是線粒體ATP敏感性鉀離子通道之一，本研究發(fā)現(xiàn)，二氮嗪能夠顯著促進Kir6.2的表達，且呈劑量依賴性，說明二氮嗪在體內(nèi)有效促進線粒體ATP敏感性鉀離子通道的開放。在炎性反應中，ERK1/2信號通路的激活始于轉(zhuǎn)運和活化Raft，后者磷酸化激活 ERK1/2[18]。ERK 是一種絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)，可將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞及其核內(nèi)，介導細胞生物化學反應，如凋亡、增殖、轉(zhuǎn)化等[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)，二氮嗪能夠顯著抑制冠心病大鼠心肌細胞ERK1/2的表達。

綜上所述，線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑二氮嗪能夠?qū)π募〗M織結(jié)構(gòu)有顯著的保護作用，并且能夠緩解冠心病大鼠心肌細胞的凋亡，其作用機制可能為抑制體內(nèi)炎性反應，以及降低冠心病大鼠心肌組織中ERK1/2的表達，從而抑制心肌細胞的凋亡，但具體的治療機制還需要進一步探討。