郭 嫻 蔣丁勝 魏 翔 陳 軍

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)是致死率極高的心血管危重疾病，系主動(dòng)脈內(nèi)膜破裂，血液進(jìn)入主動(dòng)脈管壁內(nèi)使中膜發(fā)生分離，并沿主動(dòng)脈長(zhǎng)軸方向延伸形成真、假腔分離結(jié)構(gòu)。主動(dòng)脈夾層號(hào)稱“人體的定時(shí)炸彈”，一旦主動(dòng)脈壁外膜破裂，血液瞬間涌出，患者幾乎無(wú)挽救可能。據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計(jì)，主動(dòng)脈夾層發(fā)生率約6例/(10萬(wàn)人·年)，因主動(dòng)脈夾層或主動(dòng)脈瘤病死率由1999年的2.49例/10萬(wàn)人上升至2010年的2.78例/10萬(wàn)人[1]。主動(dòng)脈壁由外膜、中膜、內(nèi)膜3部分構(gòu)成。主動(dòng)脈中層囊性退變(包含彈性蛋白斷裂和平滑肌細(xì)胞減少)、纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成以及炎性浸潤(rùn)是主動(dòng)脈夾層的病理基礎(chǔ)[2]。其中，平滑肌細(xì)胞減少和胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)降解導(dǎo)致中膜退化是主動(dòng)脈夾層最經(jīng)典的特征之一，提示平滑肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和ECM的動(dòng)態(tài)平衡是影響主動(dòng)脈夾層發(fā)生的重要因素[3]。

平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell, SMC)是主動(dòng)脈中層的主要組分，約占整個(gè)主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的35%，它在維持血管壁穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[4]。SMC表型轉(zhuǎn)化，是影響血管壁穩(wěn)態(tài)的重要因素之一，在血管損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。SMC有分化型(收縮型)和去分化型(合成型)，兩種表型之間可相互轉(zhuǎn)化。生理狀態(tài)下，大部分SMC為收縮表型，維持血管彈性和機(jī)械應(yīng)力；而在病理狀態(tài)下，SMC細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，血管壁收縮功能異常、彈性變差、抗擴(kuò)張能力下降。有文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)類型細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡進(jìn)程受到改變細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)或張力產(chǎn)生相關(guān)因子的調(diào)控[6]。

Transgelin編碼SM22(smooth muscle 22)蛋白，是平滑肌細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，屬于鈣調(diào)節(jié)蛋白家族，它是SMC收縮表型的標(biāo)志分子。Transgelin在體內(nèi)和體外均能與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)收縮纖絲蛋白使SMC展現(xiàn)出分化/收縮表型[2]。盡管Transgelin基因?qū)MC細(xì)胞功能的調(diào)控已有部分文獻(xiàn)報(bào)道，但Transgelin在主動(dòng)脈夾層中的作用尚不明確。鑒于SMC對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，而Transgelin對(duì)SMC的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，提示 Transgelin可能通過(guò)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞(vessel smooth muscle cell, VSMC)的表型轉(zhuǎn)化，從而影響主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展。本研究檢測(cè)了Transgelin在TAAD患者主動(dòng)脈壁中的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與夾層主動(dòng)脈血管壁直徑的相關(guān)性，確定Transgelin在主動(dòng)脈夾層血管壁中的表達(dá)模式，探討Transgelin作為輔助診斷主動(dòng)脈夾層的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

1.主動(dòng)脈壁來(lái)源：13例夾層主動(dòng)脈壁均取自經(jīng)CT血管成像造影(CTA)明確診斷為A型主動(dòng)脈夾層(TAAD)患者；11例無(wú)夾層主動(dòng)脈壁來(lái)自擴(kuò)心病或冠心病患者心臟移植受體，合并馬方綜合征、創(chuàng)傷性或醫(yī)源性主動(dòng)脈夾層、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等均不納入本研究，以上手術(shù)均在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院完成。本實(shí)驗(yàn)涉及到臨床標(biāo)本采集以及病患病史資料調(diào)研均獲得患者或家屬的知情同意，并經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批同意。

2.主動(dòng)脈直徑測(cè)量：在TAAD患者CTA中分別測(cè)量氣管分叉處升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、降主動(dòng)脈的峰值以及腹腔干處主動(dòng)脈直徑最大值[7]。

3.組織病理分析：主動(dòng)脈壁經(jīng)手術(shù)切除后經(jīng)冷0.9%氯化鈉注射液沖洗后，迅速置于4%中性甲醛溶液中進(jìn)行固定。充分固定后的組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色、EVG染色和免疫組化(IHC)染色[8, 9]。染色結(jié)果通過(guò)奧林巴斯光學(xué)顯微鏡BX53成像系統(tǒng)拍攝圖片。

4.總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR分析：稱取約50mg主動(dòng)脈壁組織，用Trizol法提取總RNA, 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)采用兩步法將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用SYBR?Green Supermix擴(kuò)增檢測(cè)Transgelin基因表達(dá)變化。以18S作為內(nèi)參，引物序列如下：18S正向引物：5′-CTCAACACGGGAAACCTCAC-3′,反向引物：5′-CGCTCCACCAACTAAGAACG-3′;Transgelin正向引物：5′-GCAGTCCAAAATCGAGAAGAAG-3′,反向引物：5′-CAGAATCACGCCATTCTTCAG-3′。

5.蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法: 稱取約50mg主動(dòng)脈壁組織用液氮研磨成粉末狀，加入300μl含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA強(qiáng)裂解液，用勻漿儀低溫勻漿。后續(xù)步驟參照文獻(xiàn)[8]。根據(jù)總蛋白免染膠結(jié)果歸一化分析，計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.臨床資料：入選患者的臨床資料見(jiàn)表1，主動(dòng)脈夾層患者和對(duì)照組之間的臨床基本資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間具有可比性。主動(dòng)脈夾層患者均經(jīng)CTA明確診斷為Stanford A型主動(dòng)脈夾層，CTA結(jié)果可見(jiàn)夾層累及部位包括升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓部、降主動(dòng)脈(圖1)。

表1 主動(dòng)脈夾層患者與對(duì)照組臨床資料對(duì)比

圖1 主動(dòng)脈夾層患者CT血管成像造影以及三維重建圖像A.主動(dòng)脈弓部；B.升主動(dòng)脈和降主動(dòng)脈；C.側(cè)位圖；D.三維重建側(cè)位圖

2.組織病理染色結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示對(duì)照組主動(dòng)脈壁中層彈性纖維、膠原纖維以及平滑肌細(xì)胞排布緊密有序，而主動(dòng)脈夾層組結(jié)構(gòu)分布較為亂序，并有明顯的紅細(xì)胞浸潤(rùn)。EVG染色結(jié)果表明，對(duì)照組主動(dòng)脈壁中彈性纖維形態(tài)完整、連續(xù)，而主動(dòng)脈夾層組主動(dòng)脈壁彈力纖維斷裂明顯并伴有量的減少(圖2)。

3.Transgelin基因在主動(dòng)脈壁組織中的分子水平檢測(cè)：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Transgelin在主動(dòng)脈壁中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Transgelin的mRNA水平在主動(dòng)脈夾層患者中有升高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。進(jìn)一步通過(guò)Western blot法檢測(cè)Transgelin的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈壁中的Transgelin蛋白水平明顯較對(duì)照組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。免疫組化進(jìn)一步研究Transgelin在主動(dòng)脈壁細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況，對(duì)照組主動(dòng)脈壁中僅有少量Transgelin的表達(dá)，而Transgelin在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈壁中表達(dá)量顯著升高，且Transgelin主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖5)。

圖2 對(duì)照和主動(dòng)脈夾層主動(dòng)脈壁HE染色及EVG染色結(jié)果

圖3 Transgelin基因在主動(dòng)脈壁中mRNA變化

圖4 Transgelin編碼的SM22蛋白在主動(dòng)脈壁中蛋白變化(A)以及相對(duì)定量結(jié)果(B)

4.Transgelin基因表達(dá)與主動(dòng)脈夾層發(fā)生的相關(guān)性分析：筆者將Transgelin的mRNA表達(dá)量與主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈直徑進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示， Transgelin的表達(dá)與主動(dòng)脈夾層患者的升主動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓部直徑擴(kuò)張無(wú)顯著相關(guān)性(圖6)。

圖5 Transgelin編碼的SM22蛋白在主動(dòng)脈壁中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況(A)以及免疫組化陽(yáng)性率定量結(jié)果(B)

圖6 主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈直徑與Transgelin mRNA表達(dá)量的相關(guān)性分析A.升主動(dòng)脈；B.主動(dòng)脈弓部

討 論

平滑肌細(xì)胞是主動(dòng)脈中膜重要的組成部分，其功能(表型轉(zhuǎn)化、遷移、炎癥、自噬、增殖、死亡等)紊亂與主動(dòng)脈夾層發(fā)生密切相關(guān)[9～13]。已有文獻(xiàn)報(bào)道Transgelin基因編碼的SM22蛋白在平滑肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。如SM22能抑制血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖,促進(jìn)收縮型VSMC遷移，抑制合成型VSMC細(xì)胞遷移，顯示出兩種不同細(xì)胞表型的調(diào)控模式[5,14]。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)Transgelin在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈壁中表達(dá)顯著升高，提示可能在主動(dòng)脈夾層發(fā)生過(guò)程中由于平滑肌細(xì)胞的減少，存活的平滑肌細(xì)胞為了代償其功能，會(huì)進(jìn)一步增加收縮蛋白Transgelin的表達(dá)，以期維持主動(dòng)脈壁的正常功能。

此外，有研究報(bào)道在VSMC中過(guò)表達(dá)SM22能抑制促炎性細(xì)胞因子淋巴毒素，刺激介導(dǎo)的NF-κB炎癥信號(hào)通路激活[15]。在動(dòng)脈損傷模型中SM22基因敲除小鼠體內(nèi)線粒體和NAPDH氧化酶活性增強(qiáng)導(dǎo)致活性氧增多, 炎癥基因表達(dá)上調(diào)[16]。以上研究提示SM22不僅與VSMC的增殖、遷移相關(guān)，還參與VSMC以及主動(dòng)脈壁中的炎性反應(yīng)。眾所周知，炎性反應(yīng)對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要，其不僅參與主動(dòng)脈夾層的起始，且與主動(dòng)脈夾層的進(jìn)一步發(fā)展乃至夾層破裂均密不可分[17]。盡管SM22可參與VSMC中炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但其并不是主要的炎癥調(diào)控分子。因此，雖然Transgelin在夾層患者主動(dòng)脈壁中代償性的升高，但其可能并不足以逆轉(zhuǎn)主動(dòng)脈夾層患者的炎性反應(yīng)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈夾層患者中Transgelin的mRNA水平雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其蛋白水平則顯著上調(diào)，說(shuō)明Transgelin蛋白水平的升高不僅與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，可能還與其蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)。此外，由于本研究納入的樣本偏少，而由于遺傳背景、用藥品種以及時(shí)間不同，導(dǎo)致臨床樣本之間的差異又較大，最終導(dǎo)致其mRNA和蛋白水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。將Transgelin的mRNA表達(dá)量與夾層患者的主動(dòng)脈直徑進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Transgelin的表達(dá)與主動(dòng)脈直徑并無(wú)明顯的相關(guān)性，提示Transgelin可能并不參與主動(dòng)脈病變的進(jìn)展，而只是與主動(dòng)脈夾層的發(fā)生相關(guān)。然而，Transgelin對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生、發(fā)展有何影響，何種機(jī)制參與其中？以上問(wèn)題還需通過(guò)更深入的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探討。本研究結(jié)果為將來(lái)的研究提供了一定的基礎(chǔ)，且提示Transgelin有望成為輔助診斷主動(dòng)脈夾層的生物學(xué)標(biāo)志物。