尹 佳 徐恩杰 馬 驍 周許輝

骨肉瘤是一種源自間充質(zhì)細(xì)胞的惡性骨腫瘤疾病，是兒童和青少年中最常見的惡性腫瘤之一[1]。骨肉瘤的特點是易早期轉(zhuǎn)移，約15%～25%的患者在確診骨肉瘤時可檢測到肺部轉(zhuǎn)移[2]。骨肉瘤的主要治療方法為腫瘤切除術(shù)和非特異性聯(lián)合化療[3,4]。隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤患者的長期生存率有所提高，但合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者其生存率仍非常低[5,6]。尋找新的、更有效的骨肉瘤治療靶點以降低腫瘤轉(zhuǎn)移、改善患者的生存時間成為研究的重點。

HMGN2的異常表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)[7,8]。HMGN2在乳腺癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，能抑制膀胱癌細(xì)胞和口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9～13]。筆者之前的研究表明，在骨肉瘤細(xì)胞中以感染慢病毒的方式過表達(dá)HMGN2會抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。但目前慢病毒尚無法應(yīng)用于臨床治療。

研究表明，某些細(xì)胞可以往細(xì)胞外分泌HMGN2[15]。筆者推測釋放的HMGN2也具有抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的功能。此外，目前還沒有研究解釋HMGN2抗腫瘤功能的機制。本研究探索外源性HMGN2能否進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞并抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，并進(jìn)一步探討HMGN2在骨肉瘤細(xì)胞中的抗腫瘤機制。

材料與方法

1.材料：U-2 OS骨肉瘤細(xì)胞和HEK 293FT細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。慢病毒載體以及病毒包裝質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶、SYBR-Green預(yù)混液購自日本TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，NE-PER核蛋白提取試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，DMEM購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，McCoy′s 5a培養(yǎng)基、TRIzol試劑、Lipofactamine 2000、青霉素、鏈霉素購自美國Invitrogen公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，牛血清白蛋、flag M純化試劑盒、DAPI、結(jié)晶紫染色液購自美國Sigma-Aldrich公司，一抗及ELISA試劑盒購自英國Abcam公司，二抗購自美國CST公司，ECL曝光液購自美國Pierce公司，Trasnwell小室購自美國Coring公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基包含10%胎牛血清(FBS)、青霉素 (100U/L)和鏈霉素(100mg/L)。McCoy′s 5a培養(yǎng)基包含15% FBS、青霉素 (100U/L) 和鏈霉素 (100mg/L)。筆者選擇兩個骨肉瘤細(xì)胞系用于后續(xù)實驗。將U-2 OS 骨肉瘤細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將Saos-2 骨肉瘤細(xì)胞在McCoy′s 5a培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在Saos-2細(xì)胞中重復(fù)從U-2 OS細(xì)胞實驗中得到的遷移和侵襲的實驗結(jié)果。將HEK 293 FT細(xì)胞在DMEM中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.HMGN2的過表達(dá)和蛋白純化：過表達(dá)慢病毒載體購自上海吉凱公司(GV492，元件順序：Ubi-MCS-3flag-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，中國上海)。用過表達(dá)慢病毒(HMGN2-flagoe組)和空白慢病毒(oeCON組)感染293FT細(xì)胞。通過預(yù)實驗確定U-2 OS細(xì)胞病毒感染的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，Saos-2的MOI為15，并基于該MOI值進(jìn)行了正式實驗。為了增加陽性細(xì)胞的比例，在細(xì)胞感染3天后進(jìn)行流式分選，并繼續(xù)培養(yǎng)帶綠色熒光的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合率時，收集細(xì)胞并提取RNA，并通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)確認(rèn)過表達(dá)效率。在確認(rèn)HMGN2的過表達(dá)效率后，收集過表達(dá)HMGN2的細(xì)胞并使用NE-PER核蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)提取核蛋白，并應(yīng)用flag M純化試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)純化HMGN2-flag蛋白。通過ELISA(ab49763，英國Abcam公司)確認(rèn)HMGN2的濃度。

4.實時熒光定量PCR(RT-qPCR)：以SYBR-Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)和ABI Prism 7900HT(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行RT-qPCR，以定量測定HMGN2、MMP-2、MMP-9、MMP-16的表達(dá)水平。應(yīng)用TRIzol(美國Invitrogen公司)提取每組細(xì)胞的總RNA，使用Reverse Transcription試劑盒(美國Applied Biosystems公司)將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用特異性引物擴(kuò)增基因，人β-actin基因為內(nèi)參。使用的PCR引物序列為以下：HMGN2：正向引物：5′-CGATTGTCTGCCCATGTCCT-3′，反向引物：5′-GCAGAACGTACCCTGTTCCA-3′; MMP-2：正向引物：5′-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3′，反向引物：5′-GGTCACATCGCTCCAGACT-3′; MMP-9：正向引物：5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，反向引物：5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′; MMP-16：正向引物：5′-AGCACTGGAAGACGGTTGG-3′，反向引物：5′-CTCCGTTCCGCAGACTGTA-3′; β-actin：正向引物：5′-ACCGAGCGCGGCTACAG-3′，反向引物：5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。采用2-ΔΔCt法分析并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。用相同的樣品和相同的引物重復(fù)RT-qPCR實驗3次。

5.Western blot法檢測：使用NE-PER核蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher公司)提取核蛋白，并使用蛋白質(zhì)提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取總蛋白，并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白濃度。獲得的蛋白溶液在SDS-PAGE凝膠上電泳，分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國Millipore公司)上，并在5%牛血清白蛋白(BSA，美國Sigma-Aldrich公司)中封閉。用對應(yīng)的一抗在4℃下孵育過夜。使用的抗體如下：抗HMGN2(1∶1000稀釋，ab199679，英國Abcam公司)，抗DDDDK(1∶1000稀釋，ab49763，英國Abcam公司)、抗MMP2(1∶500稀釋，ab97779，英國Abcam公司)、抗MMP9(1∶1000稀釋，ab76003，英國Abcam公司)、抗MMP16(1∶500稀釋，ab73877，英國Abcam公司)、抗LMNB1(1∶10000稀釋，ab16048，英國Abcam公司)、抗β-actin(1∶10000稀釋，ab8226，英國Abcam公司)。然后在室溫下用二抗孵育膜1h。使用ECL曝光液(No.32106，美國Pierce公司)顯影，并進(jìn)行觀察、拍攝。

6.免疫細(xì)胞化學(xué)：用濃度為10μg/ml的純化HMGN2蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞24h，然后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min，用0.1%Triton X-100的PBS溶液透化5min， 用1%BSA封閉細(xì)胞2h。將細(xì)胞在抗DDDDK抗體(1∶100稀釋，ab49763，英國Abcam公司)中4℃孵育過夜。然后將細(xì)胞在帶紅色熒光的二抗(美國Cell Signaling Technology公司)中孵育1h， PBS洗滌后用DAPI(美國Sigma-Aldrich公司)封固。觀察HMGN2-flag的細(xì)胞定位并使用共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)拍攝。

7.劃痕試驗：在HMGN2-flag組中，用濃度為10μg/ml的純化HMGN2-flag蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞24h。對照組(UT組)加入等量的蛋白純化洗脫緩沖液。之后將兩組骨肉瘤細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中并生長至90%融合率。使用200μl微量移液管尖端建立劃痕，監(jiān)測細(xì)胞向劃痕中心的遷移并拍照。遷移率(%)=(S0h-S24h或S48h)/ S0h×100%。S0h是建立的劃痕寬度，S24h或S48h是建立劃痕24h或48h后的寬度。

8.Transwell侵襲試驗：細(xì)胞預(yù)處理方式同劃痕試驗。在6.5mm Transwell中測定細(xì)胞的侵襲能力差異。上室用涂覆50μl稀釋的基質(zhì)膠，下室加入500μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(或含有15%FBS的McCoy′s 5a培養(yǎng)基)。將細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中并加入上室中。將細(xì)胞培養(yǎng)24h，除去未侵襲的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定侵襲細(xì)胞30min，然后用結(jié)晶紫染色液染色。計數(shù)侵襲細(xì)胞并統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

1.HMGN2蛋白過表達(dá)與純化：HMGN2過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒測序結(jié)果顯示序列正確(圖1A)。以慢病毒感染的方式在293FT細(xì)胞中過表達(dá)HMGN2，RT-qPCR結(jié)果顯示HMGN2-flagoe組HMGN2-mRNA的表達(dá)水平顯著高于oeCON組(圖1B)。提取兩組細(xì)胞的核蛋白，oeCON的總核蛋白為oeCON組，HMGN2-flagoe組的核蛋白利用flag標(biāo)簽進(jìn)一步純化，獲得的純化蛋白為HMGN2-flag組，通過Western blot法進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果顯示使用抗HMGN2抗體兩組中均檢測到條帶，且HMGN2-flag組的蛋白由于是攜帶flag標(biāo)簽的融合蛋白，其相對分子質(zhì)量較oeCON組稍大(圖1C)，使用抗DDDDK抗體在HMGN2-flag組和flag-BAP組中檢測到條帶，而在對照組中未檢測到條帶(圖1D)。

圖1 HMGN2蛋白過表達(dá)與純化A.HMGN2過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒測序結(jié)果；B.RT-qPCR確認(rèn)過表達(dá)效率；C.HMGN2-flag純化和Western blot法檢測。使用抗HMGN2抗體在HMGN2-flag組中檢測到HMGN2。D.使用抗DDDDK抗體在HMGN2-flag組和陽性對照flag-BAP組中檢測到條帶。flag-BAP.攜帶flag標(biāo)簽的融合蛋白，相對分子質(zhì)量為49.3kDa。oeCON組.oeCON組的核蛋白提取物;HMGN2-flag組.HMGN2-flagoe組的核蛋白經(jīng)純化后的帶flag標(biāo)簽的蛋白

2.外源性HMGN2轉(zhuǎn)運到骨肉瘤細(xì)胞和細(xì)胞核中：用濃度為10μg/ml的純化HMGN2-flag蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞24h，通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測外源蛋白的細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，真核細(xì)胞表達(dá)的HMGN2可在處理24h后轉(zhuǎn)運到骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖2)。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)實驗檢測外源性HMGN2入胞及細(xì)胞定位(×1000)A.紅色：HMGN2-flag融合蛋白；B.藍(lán)色：細(xì)胞核；C.疊加效果

3.外源性HMGN2抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲：劃痕試驗結(jié)果顯示HMGN2-flag組中骨肉瘤細(xì)胞的遷移顯著低于UT組(圖3中A～C)。Transwell侵襲試驗顯示，HMGN2-flag組中骨肉瘤細(xì)胞的侵襲較UT組顯著降低(圖3中D～E)。

圖3 劃痕試驗和Transwell侵襲試驗檢測外源性添加HMGN2對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×100)A.劃痕實驗及顯微鏡監(jiān)測；B.兩組在建立劃痕后24h的遷移率統(tǒng)計分析；C.兩組在建立劃痕后48h的遷移率統(tǒng)計分析；D.Transwell侵襲試驗及染色觀察；E.計數(shù)兩組侵襲細(xì)胞并統(tǒng)計分析

4.外源性HMGN2調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)：通過RT-qPCR和Western blot法檢測各組細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9和MMP-16的表達(dá)水平。RT-qPCR(圖4中A～C)和Western blot法檢測(圖4D)結(jié)果顯示HMGN2-flag組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著低于UT組，而MMP-16的表達(dá)水平兩組比較間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 RT-qPCR和Western blot法檢測兩組MMPs的表達(dá)差異A～C.分別為兩組間MMP-2、MMP-9、MMP-16的mRNA表達(dá)水平差異；D.兩組間MMP-2、MMP-9、MMP-16的蛋白表達(dá)水平差異

討 論

目前尚沒有研究闡述HMGN2抗腫瘤功能的機制。筆者選擇MMPs進(jìn)行分析，是因為有較多研究顯示MMPs受其他HMGN家族成員調(diào)控，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[16-19]。大約有20%的骨肉瘤患者在初次診斷時即發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移，而25%～50%的患者則隨著病情發(fā)展出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[20]。骨肉瘤的主要治療方法是化療和外科手術(shù)，然而即使在手術(shù)切除和化療后，這些患者中的大多數(shù)最終會發(fā)生轉(zhuǎn)移并死亡。大約90%的骨肉瘤患者在手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[21]。因此，亟需要開發(fā)抗骨肉瘤轉(zhuǎn)移的新型治療方案。

在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用的高遷移率族蛋白(HMG)包括HMGA，HMGB和HMGN。HMGNs主要定位于細(xì)胞核中且僅在真核生物中表達(dá)，含有核小體結(jié)合域(NBD)，HMGN2是HMGN家族的成員。早期研究表明，HMGN2是一種非組蛋白核蛋白，在脊椎動物和無脊椎動物的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它具有穩(wěn)定核小體形態(tài)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能，其NBD的N末端與組蛋白結(jié)合，而C末端與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[22]。HMGN2缺陷型DT40細(xì)胞對紫外線敏感，細(xì)胞凋亡率增加，表明HMGN2在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[23]。多項研究表明HMGN2的異常表達(dá)與多種腫瘤有關(guān)，并視為一類抗腫瘤因子[7～12]。已有研究證明HMGN2可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。筆者之前的研究表明，以慢病毒感染的方式在骨肉瘤細(xì)胞中過表達(dá)HMGN2會抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。然而，目前慢病毒不適用于臨床治療。

IL-2刺激人外周血單核細(xì)胞釋放HMGN2。舌鱗狀細(xì)胞癌抗原刺激CD8+T淋巴細(xì)胞釋放HMGN2[15]。為探討外源性HMGN2是否能進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞，本研究純化了HMGN2-flag融合蛋白，并在骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)添加該融合蛋白，通過免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)檢測蛋白定位。結(jié)果顯示外源性HMGN2能進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞并最終位于細(xì)胞核中。為了了解外源性HMGN2是否抑制骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，本研究用純化的HMGN2蛋白處理骨肉瘤細(xì)胞，并通過劃痕試驗和Transwell侵襲試驗檢測各組骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的差異。結(jié)果表明，外源性HMGN2進(jìn)入細(xì)胞可抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果可為抗腫瘤藥物的研究提供新的思路。

研究表明HMGN2具有抗腫瘤活性。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制和腫瘤靶向肽研究表明HMGN2可能是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶標(biāo)。研究人員從牛肝中提取了21個氨基酸的肽，稱為侵襲抑制劑2(IIF-2)，其被鑒定為與HMGN2的C末端片段一致。體外研究顯示該肽抑制多個腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。而動物研究表明，同時將IIF2和肺癌細(xì)胞注射到小鼠尾靜脈可使轉(zhuǎn)移較對照組減少50%～60%。IIF-2與白蛋白結(jié)合可提高其穩(wěn)定性，并使轉(zhuǎn)移形成減少86%。此外，Porkka等還發(fā)現(xiàn)HMGN2還與腫瘤血管生成相關(guān)，從而影響腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，目前還沒有研究解釋HMGN2抗腫瘤功能的機制。

目前已經(jīng)在幾乎所有類型的人類癌癥中檢測到了MMPs的激活，并且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移以及較差的存活時間密切相關(guān)。有證據(jù)表明HMGN家族成員能調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，并在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16～19]。在開始本項研究前，筆者推測HMGN2可能通過下調(diào)MMPs來發(fā)揮抗腫瘤作用。而本研究結(jié)果表明，外源性HMGN2能下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，并在抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮作用。

本研究證實了外源性HMGN2在骨肉瘤細(xì)胞中的抗腫瘤作用。然而，研究結(jié)果還需要大量的體內(nèi)實驗結(jié)果來進(jìn)一步證實。在下一步研究中將HMGN2和骨肉瘤細(xì)胞同時注射到裸鼠的尾靜脈中，以進(jìn)一步確定外源性HMGN2抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，在之前的研究中證實了過表達(dá)HMGN2在人骨肉瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。而本研究顯示，外源性HMGN2能進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞并調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，最終有助于抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。這些結(jié)果為骨肉瘤抗轉(zhuǎn)移藥物的研發(fā)提供了新思路，HMGN2類似物或刺激細(xì)胞HMGN2釋放的藥物可作為藥物研發(fā)的備選。