李 斐 吳 超 張 弛 馮一艦 鐘 重

(浙江省生態(tài)環(huán)境科學設計研究院，浙江 杭州 310007)

錳(Mn)是自然環(huán)境中活躍的過渡金屬，在微生物的催化作用下Mn(Ⅱ)能被氧化生成生物錳氧化物(Mn(Ⅲ)和Mn(Ⅳ))[1]。生物錳氧化物因其高反應活性和強吸附能力，顯著影響環(huán)境污染物和營養(yǎng)物質的遷移轉化，在多種元素的生物地球化學循環(huán)過程中起著非常重要的作用[2]。因此，錳氧化微生物及其代謝產物和代謝機理已經成為當前環(huán)境領域的研究熱點。本研究主要綜述了目前報道的錳氧化微生物分類、錳氧化代謝途徑以及生物錳氧化在土壤環(huán)境中的作用。

1 錳的形態(tài)及微生物氧化作用

地殼中錳的豐度約為0.1%，是僅次于鐵(約5%)和鈦(約0.5%)的第三大過渡金屬[3]，廣泛分布于土壤、沉積物等各類環(huán)境中。錳是生命所需的微量元素，是許多酶和蛋白的輔因子[4]。錳具有多種化合價，包括+2、+3、+4、+5、+6、+7價，但在自然環(huán)境中通常以+2、+3、+4價存在，即Mn(Ⅱ)、Mn(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)[5]。其中水溶液中+2價還原態(tài)的錳離子最為穩(wěn)定，水溶性最好，一般不易被化學氧化。Mn(Ⅳ)是最主要的氧化態(tài)錳，通常以二氧化錳固體的形式存在，具有較強的氧化性。二氧化錳是多種有機和無機物的氧化劑，也是許多化學反應的催化劑，比如雙氧水分解產氧反應。近十年，Mn(Ⅲ)成為環(huán)境錳循環(huán)研究的焦點，已發(fā)現(xiàn)絡合態(tài)Mn(Ⅲ)在沉積物好氧/厭氧交界處、海底孔隙水、含氧水等區(qū)域中的含量占總溶解錳的86%甚至100%。Mn(Ⅲ)存在于許多礦物中，常常與Mn(Ⅳ)形成混合價態(tài)的氧化物。由于Mn(Ⅲ)既可作為電子受體，又可作為電子供體，因此Mn(Ⅲ)在錳循環(huán)中有著舉足輕重的作用[6],[7]1244。

在一般環(huán)境條件下(pH>3.0)，雙電子的錳氧化反應，即Mn(Ⅱ)氧化為Mn(Ⅳ)，是自發(fā)的熱力學過程。但在非堿性條件下(pH<8.5)，化學錳氧化反應受到動力學限制，反應速率非常緩慢。然而，有微生物催化時，Mn(Ⅱ)氧化速率至少可以提高5個數(shù)量級[8]373,[9]。因此，自然環(huán)境中生成的錳氧化物，如土壤中的錳結核，一般認為是生物氧化作用的結果。這些生物成因的錳氧化物往往晶型較差，具有很強的吸附性和氧化性，能有效吸附多種重金屬，改變重金屬的遷移轉化規(guī)律；也能氧化一些還原性物質，從而促進其他元素的地球化學循環(huán)，如硫化物、有機碳等[10]。土壤環(huán)境中已經檢測到豐富并且活躍的錳氧化微生物以及它們的代謝產物——生物錳氧化物，這說明錳氧化微生物在土壤元素生物地球化學循環(huán)以及污染物凈化方面起著重要作用[11]2。

2 錳氧化微生物分類

目前已經發(fā)現(xiàn)許多細菌可以氧化Mn(Ⅱ)，錳氧化細菌主要隸屬于低鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量的厚壁菌門(Firmicutes)、高GC含量的放線菌門(Actinobacteria)以及變形菌門(Proteobacteria)的α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱，研究較為深入的錳氧化細菌有芽孢桿菌(Bacillussp.)SG-1、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)MnB1/GB-1以及生盤纖發(fā)菌(Leptothrixdiscophora)SS-1(見表1)[8]373，其他報道的錳氧化細菌還有節(jié)桿菌(Arthrobacter)[22]、埃希氏桿菌(Escherichia)、壤霉菌(Agromyces)、纖維單胞菌(Cellulomonas)、貪銅菌(Cupriavidus)、細桿菌(Microbacterium)、羅爾斯頓菌(Ralstonia)、貪噬菌(Variovorax)[11]3、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)、紅球菌(Rhodococcus)、鹽單胞菌(Halomonas)、產微球莖菌(Microbulbifer)、亞硫酸桿菌(Sultobacter)、交替單胞菌(Alteromonas)[23]、氣單胞菌(Aeromonas)[24]、Xuhuaishuia[25]等。目前報道的大多錳氧化細菌同時可以氧化Fe(Ⅱ)，但也存在一些細菌只能氧化Fe(Ⅱ)，例如披毛菌(Gallionella)，另一些細菌只能氧化Mn(Ⅱ)，例如錳氧化假單胞菌(Pseudomonasmanganoxidans)[26]。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)許多真菌也能氧化Mn(Ⅱ)，比如：曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、支頂孢屬(Acremonium)等[27]7383。

3 生物錳氧化代謝途徑

目前發(fā)現(xiàn)的微生物錳氧化過程由細菌和真菌兩大類生物完成。研究發(fā)現(xiàn)，細菌的錳氧化活性與細菌的生長有直接關系，通常在生長穩(wěn)定期的開始階段，胞內合成錳氧化因子(MOF)并釋放到胞外，Mn(Ⅱ)在胞外MOF的催化下氧化為錳氧化物并沉淀于細胞外表面[28]。目前，研究比較深入的錳氧化途徑主要有MCOs途徑[29]和AHPs途徑[21]3935。真菌的錳氧化主要包括非酶促和酶促兩類過程，非酶促途徑主要是真菌的代謝產物或自身細胞將Mn(Ⅱ)氧化；酶促途徑則是真菌分泌酶，通過過氧化氫或酚類等物質的輔助將Mn(Ⅱ)氧化為Mn(Ⅲ)。盡管錳氧化微生物種類繁多，代謝途徑多樣，但主要的氧化產物一般是二氧化錳，Mn(Ⅱ)氧化為Mn(Ⅳ)由兩個連續(xù)的單電子反應組成，Mn(Ⅲ)是其中間產物。

3.1 細菌MCOs錳氧化途徑

許多細菌利用MCOs家族錳氧化酶進行錳氧化，這些MCOs包括生盤纖發(fā)菌SS-1的MofA、惡臭假單胞菌GB-1的MnxG和McoA、芽孢桿菌SG-1的MnxG和CotA、短芽胞桿菌MK-8的CopA以及土微菌ACM的MoxCBA(見表1)。MCOs的催化中心由多個銅原子組成，可以完成從基質到氧分子的單電子轉移，其中基質包括Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、木質素等[7]1245。不同來源MCOs氨基酸序列的同源性較低(<20%)，但在銅結合位點處都具有非常保守的氨基酸序列，銅結合位點處氨基酸的殘基按照一定規(guī)則有序排列，可以將銅原子結合在酶的特定位置[30]。研究者認為MCOs家族錳氧化酶的多銅中心包括1個Ⅰ型的銅結合位點以及2個Ⅱ型和1個TypeⅢ組成的3銅催化中心。反應基質首先與TypeⅠ的銅結合位點結合，1個電子由基質轉移到銅原子，然后再轉移到3銅催化中心，最終轉遞給氧分子，得電子后的氧分子與質子結合生成水分子[31]。多個宏觀和微觀的實驗已經證實錳氧化菌MCOs的輔因子是銅原子[7]1245。在多銅中心(4個銅原子)處，Mn(Ⅱ)失去1個電子，被氧化為Mn(Ⅲ)。Mn(Ⅲ)離開基質位點，先被轉移到持有位點，然后再被轉移到雙核位點。雙核位點的Mn(Ⅲ)將另1個電子傳遞給持有位點的Mn(Ⅲ)，自身氧化為Mn(Ⅳ)，并形成氧橋，最終獲得產物二氧化錳。持有位點的Mn(Ⅲ)獲得電子后，被還原為Mn(Ⅱ)，返回到基質位點，進行下一個電子轉移反應[8]376。上述Mn(Ⅱ)氧化反應的第2步單電子轉移反應，其本質是歧化反應，Mn(Ⅲ)自身發(fā)生氧化還原反應，歧化為Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅳ)。當然，目前的實驗發(fā)現(xiàn)并不能排除Mn(Ⅲ)繼續(xù)被氧氣氧化為Mn(Ⅳ)的可能[32]。

表1 典型的錳氧化細菌及其錳氧化酶

3.2 細菌AHPs錳氧化途徑

2009年，研究者發(fā)現(xiàn)了細菌的另一類錳氧化酶，并命名為MopA，該酶屬于AHPs家族，該酶的結構和錳氧化方式與MCOs完全不同[20]4130。根據(jù)已有的研究報道，橙單胞菌SI85-9A1、赤桿菌SD-21、惡臭假單胞菌GB-1和玫瑰桿菌AzwK-3b可以利用AHPs進行錳氧化(見表1)。一般認為，前3者通過AHPs直接氧化Mn(Ⅱ)，玫瑰桿菌則是利用AHPs產生胞外超氧自由基，再由超氧自由基氧化Mn(Ⅱ)[21]3930。在AHPs的直接氧化過程中，Mn(Ⅱ)首先被氧化成Mn(Ⅲ)，在橙單胞菌和赤桿菌的錳氧化反應液中檢測到了Mn(Ⅲ)的存在[20]4135。Mn(Ⅲ)再通過歧化反應或者進一步被氧氣氧化，生成終產物Mn(Ⅳ)。錳氧化過程屬于次級代謝，橙單胞菌和赤桿菌的MopA表達受Mn(Ⅱ)誘導，在無Mn(Ⅱ)的條件下，MopA并不表達[20]4137。早期發(fā)現(xiàn)的AHPs通常以過氧化氫作為直接的電子受體，而上述MopA的錳氧化能力并不受過氧化氫含量影響，說明過氧化氫可能不是MopA的直接電子受體[33]。

與直接氧化不同，玫瑰桿菌AzwK-3b氧化Mn(Ⅱ)的過程中有胞外超氧自由基的參與。在反應體系中，研究者檢測到了超氧自由基的產生，而添加超氧化物歧化酶(SOD)消耗體系的超氧自由基后，幾乎檢測不到錳氧化活性；添加過氧化氫酶則并不抑制錳氧化活性[34]。通過添加具有螯合作用的焦磷酸，在該體系中檢測到了Mn(Ⅲ)的存在[21]3930。根據(jù)上述實驗現(xiàn)象，研究者推測玫瑰桿菌AzwK-3b首先利用AHPs產生胞外超氧自由基(見式(1))，超氧自由基將Mn(Ⅱ) 氧化為Mn(Ⅲ)，自身還原為過氧化氫(見式(2))，Mn(Ⅲ)通過繼續(xù)氧化(見式(3))或歧化反應(見式(4))生成Mn(Ⅳ)，Mn(Ⅳ)最終生成二氧化錳礦物(見式(5))。此外，研究者認為生成的中間產物過氧化氫應該被迅速分解，以避免將Mn(Ⅲ) 還原為Mn(Ⅱ)，所以玫瑰桿菌AzwK-3b可能具有豐富的消耗過氧化氫的酶系，AHPs也可能可以消耗過氧化氫[21]3928。值得注意的是，雖然玫瑰桿菌AzwK-3b被證實是利用胞外超氧自由基實現(xiàn)Mn(Ⅱ)的氧化，然而其他很多能產生胞外超氧自由基的菌株并不能氧化Mn(Ⅱ)，這說明玫瑰桿菌AzwK-3b具有其特殊的途徑保障胞外超氧自由基對Mn(Ⅱ)的氧化，但具體機理還有待研究[35]。

(1)

(2)

Mn(Ⅲ)+1/4O2+H+→Mn(Ⅳ)+1/2H2O

(3)

Mn(Ⅲ)→1/2Mn(Ⅱ)+1/2Mn(Ⅳ)

(4)

Mn(Ⅳ)+2H2O→MnO2+4H+

(5)

3.3 真菌錳氧化途徑

真菌對錳的氧化包括非酶促和酶促兩類過程。在非酶促途徑中，Mn(Ⅱ)可能被真菌的一些代謝產物或者自身細胞內物質所氧化，比如羥基酸[27]7385。在酶促途徑中，真菌分泌的漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶可以將Mn(Ⅱ)氧化為Mn(Ⅲ)[36]。木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶可以催化過氧化氫氧化Mn(Ⅱ)，生成Mn(Ⅲ)，而漆酶則需要酚類物質的輔助，才能將Mn(Ⅱ)氧化為Mn(Ⅲ)[37]。目前報道的真菌只能將Mn(Ⅱ)氧化為Mn(Ⅲ)，最終獲得的Mn(Ⅳ)可能由Mn(Ⅲ)的化學歧化反應獲得。由于真菌分泌的很多小分子有機酸可以螯合或者還原Mn(Ⅲ)，這顯著降低了錳氧化物的產生速率[38]。此外，類似于玫瑰桿菌AzwK-3b，研究者發(fā)現(xiàn)子囊菌絲狀真菌(Stilbellaaciculosa)也是利用胞外超氧化物實現(xiàn)Mn(Ⅱ)的氧化。當胞外超氧化物被清除或者煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶被抑制后，該真菌的錳氧化能力隨即消失[39]。

4 土壤環(huán)境中生物錳氧化作用

土壤環(huán)境中錳含量較高(質量分數(shù)約為0.25%)，存在豐富的錳氧化微生物和生物錳氧化物。與化學成因的錳氧化物相比，生物錳氧化物具有更差的晶型，因此呈現(xiàn)出更強的氧化性和吸附性。生物錳氧化物可與環(huán)境介質中多種無機和有機化合物發(fā)生物理化學反應，對土壤、沉積物和地下水中的化學組成與性質具有極大影響。

4.1 重金屬污染物的吸附氧化

目前報道的生物錳氧化物中錳元素多以Mn(Ⅳ)存在，晶體基本單元是正八面體結構(MnO6)，這些基本單元組成層狀結構，晶型接近于δ-MnO2[40-41]。新生成的生物錳氧化物具有較多的Mn(Ⅳ)空缺，呈電負性，在土壤中可以吸附多種重金屬污染物，例如：Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)、As(Ⅲ) 、As(Ⅴ)等，也能吸附未氧化的Mn(Ⅱ)[42-43]。

NELSON等[44-45]研究了生盤纖發(fā)菌生成的錳氧化物對Pb(Ⅱ)的吸附特性，并與化學錳氧化物和商業(yè)錳氧化物進行對比。結果表明，生盤纖發(fā)菌生成的錳氧化物對Pb(Ⅱ)的吸附量可達520 mmol/mol，是化學錳氧化物及商業(yè)錳氧化物的2～5倍。TANI等[46]對比了錳氧化真菌KR21-2生成的錳氧化物與化學錳氧化物對重金屬的吸附效果，發(fā)現(xiàn)生物錳氧化物對Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的吸附效率比化學錳氧化物(γ-MnO2)高10倍左右。LIANG等[47]利用微桿菌(Microbacterium)CSA40生成了錳氧化物，該錳氧化物可同時進行As(Ⅲ)氧化和As(Ⅴ)吸附，0.5 g/L的生物錳氧化物可去除污染地下水中90%以上的砷(砷初始質量濃度為1 000 μg/L)，被認為是一種環(huán)境友好、經濟高效的地下水As(Ⅲ)污染修復材料。ZHOU等[48]以惡臭假單胞菌MnB1為菌劑成功制備了納米級生物錳氧化物，發(fā)現(xiàn)該生物錳氧化物對Pb(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的吸附能力是化學錳氧化物的7～8倍。然而需要注意的是，錳氧化物能將低毒性低遷移性的Cr(Ⅲ)氧化為高毒性高遷移性的Cr(Ⅵ)，并且生物錳氧化物的氧化速率是化學錳氧化物的7倍[49],[50]166,[51]。因此，當利用生物錳氧化物修復重金屬污染土壤時，需考慮Cr(Ⅵ)的次生污染問題。

研究人員也對生物錳氧化物吸附重金屬的機理進行了研究。VILLALOBOS等[52]將可能的吸附機理分為兩類：(1)靜電吸附，在金屬陽離子的總吸附比例中約占25%～50%；(2)表面絡合吸附，所占比例可以達到50%～75%。此外，WU等[50]165提出了第3種吸附機理：金屬陽離子可以在不同空位與錳氧化物結合形成不同的復合物，進入空位的金屬陽離子能與晶格中相鄰的氧原子形成兩種不同的配合物，即3邊共享的內層復合體和兩邊共享的表面復合體。

4.2 有機污染物的氧化降解

生物錳氧化物具有非常強的氧化性，被認為是自然界中氧化能力最強的幾種氧化劑之一，可以氧化降解多種土壤有機物，包括除草劑、抗生素以及各種小分子有機物[53-55]。

ZHANG等[56]將δ-MnO2與7種氟喹諾酮類抗菌藥物進行反應，結果表明錳氧化物與環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星和氧氟沙星之間具有良好的反應活性，但與洛美沙星和吡哌酸的反應活性較差，證實了土壤中的錳氧化物在非生物途徑降解氟喹諾酮類抗菌藥物的過程中起了重要作用。LU等[57]利用類似手段，證實了土壤中二氧化錳對壬基酚有去除作用。LUO等[58]利用Pleosporalessp.Y-5制備了具有層狀結構的鈷錳氧化物，并將其用于非均相四環(huán)素的降解。結果表明鈷錳氧化物具有良好的催化性能，反應10 min四環(huán)素去除率接近100%。連續(xù)重復試驗5次后仍能較好去除四環(huán)素，表現(xiàn)出良好的重復利用性。FORREZ等[59]利用惡臭假單胞菌MnB1產生的錳氧化物降解雙氯芬酸，結果發(fā)現(xiàn)在中性pH下，該錳氧化物氧化雙氯芬酸的速率比化學合成的二氧化錳快10倍。降解過程中Mn(Ⅱ)質量濃度始終低于0.05 mg/L，說明錳氧化菌可利用被雙氯芬酸還原的Mn(Ⅱ)繼續(xù)產生錳氧化物。KIM等[60]發(fā)現(xiàn)7.9 mg/L的微生物錳氧化物可使合成雌激素(1 mg/L)在2 h內降解87%。最近報道發(fā)現(xiàn)，往鄰苯二甲酸酯和As(Ⅲ)污染的土壤中接種錳氧化微生物，可以同時快速修復受污染土壤，并且不引起土壤土著微生物菌群的明顯變化，顯著減輕土壤修復導致的土壤板結、肥力降低等副作用[61]。

4.3 對自然界碳素循環(huán)的促進

植物根、莖、葉等細胞衰亡后，在土壤中殘留大量難降解的顆粒性有機碳(POC)，這些POC的降解也被認為與土壤錳氧化有重要關聯(lián)[62]。在某些土壤中，錳的豐度與POC的氧化速率之間存在很強的正相關關系[63]12349,[64]，即錳的生物有效性、遷移性和反應性對POC分解速率有顯著影響，對自然界的碳素循環(huán)具有促進作用[65]。

SUNDA等[66]發(fā)現(xiàn)錳氧化物可將微生物不能直接利用的腐殖酸氧化為小分子有機物，如丙酮、甲醛、乙醛等，這些小分子有機物可作為微生物的生長底物從而促進其生長。錳氧化物，尤其是Mn(Ⅲ)的形成，促進了木質素等生物大分子的降解。Mn(Ⅲ)是Mn(Ⅱ)生物氧化的中間產物，具有非常強的氧化性，但由于其極不穩(wěn)定，早先它的環(huán)境作用并不被關注[67]。在沒有螯合劑保護的條件下，Mn(Ⅲ)確實很快歧化為Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅳ)。但在微生物活躍的土壤環(huán)境中，存在大量Mn(Ⅲ)的螯合劑，比如草酸、檸檬酸、焦磷酸等，這些螯合劑可以穩(wěn)定Mn(Ⅲ)，并使其充分發(fā)揮氧化作用[68]。實驗已經證實這些螯合劑可以從Mn(Ⅱ)的氧化途徑中劫持中間產物Mn(Ⅲ)，并將Mn(Ⅲ)與螯合劑結合的復合物釋放到環(huán)境中。這些Mn(Ⅲ)的螯合復合物具有強氧化性，能夠降解一些難降解物質，比如土壤中大量存在的木質素[69-70]。錳在土壤環(huán)境中并非均勻分布，還原態(tài)錳(Mn(Ⅱ))主要存在于深層土壤的厭氧區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)，在土壤的好氧/厭氧交界面處，存在活躍的錳循環(huán)，Mn(Ⅱ)被大量氧化成Mn(Ⅲ)，活躍的Mn(Ⅲ)被土壤有機質還原后又可恢復為還原態(tài)，該區(qū)域被認為是土壤錳氧化微生物的重要生態(tài)位，也是錳循環(huán)影響土壤碳循環(huán)的熱點區(qū)域[63]12354。土壤好氧/厭氧交界面處活躍的錳循環(huán)總結如圖1所示。

圖1 土壤好氧/厭氧交界面處活躍的錳循環(huán)Fig.1 Active manganese cycling near oxic/anoxic interfaces in soils

5 展 望

本研究綜述了目前報道的錳氧化微生物分類、錳氧化代謝途徑以及生物錳氧化物在土壤環(huán)境中的重要作用，其中生物錳氧化物的環(huán)境作用方面，重點從生物錳氧化物對重金屬、有機污染物和POC的吸附、氧化和降解等方面展開討論。隨著分析技術的快速發(fā)展以及研究工作的進一步深入，生物錳氧化物在土壤環(huán)境中的作用必定會更加清楚?；谀壳把芯窟M展，筆者認為未來還可以從以下幾個方面開展相關研究：

(1) 目前發(fā)現(xiàn)的錳氧化微生物都是異養(yǎng)菌，并不是依靠錳氧化來獲得生長代謝所需的能量，生物錳氧化對微生物自身的意義一直存在爭議，這關系到生物錳氧化在土壤修復應用中是否需要外來營養(yǎng)源問題，直接關系應用條件及成本。

(2) 生物錳氧化物和有機物之間的界面作用對反應過程的影響尚不清楚，Mn(Ⅲ)與小分子有機物的螯合作用如何影響Mn(Ⅲ)的奪電子能力也尚不清楚，但可以確定的是，螯合作用在促進土壤Mn(Ⅲ)的穩(wěn)定性和遷移性方面具有顯著影響。

(3) 生物錳氧化物和中間產物在土壤環(huán)境中的作用還未進行充分研究，目前更多的報道在于其對緩解環(huán)境問題的積極意義，是否存在對環(huán)境的負面作用及可能的機制還不清楚。生物錳循環(huán)強化技術可能未來可用于修復受多種污染物污染的土壤，但處理效果、調控策略、工藝適用性等還有待研究，并應客觀評估，充分做好前期試驗。

(4) 現(xiàn)有研究多集中在固液兩相的簡單組分上，而土壤成分復雜，條件控制的難度較大，土壤環(huán)境中的其他成分對生物錳氧化物降解污染物的影響程度還有待研究，例如土壤中大量存在的鈉、鎂、鈣離子和小分子可溶性有機物與污染物之間的競爭吸附以及土壤中其他還原性物質對目標物的競爭作用。