陳希民,王 鑫,魏九齡,陳月曉,馬姍婕,何 梅,李 東

(北京市營養(yǎng)源研究所,北京 100069)

睡眠障礙是由于睡眠的解剖部位發(fā)生病變或生理功能紊亂引起睡眠質(zhì)量的異?；蛟谒邥r(shí)伴隨某些臨床癥狀,是睡眠和覺醒正常節(jié)律性交替紊亂的表現(xiàn)[1]。資料表明[2],兒童睡眠障礙發(fā)生率為10%～45%,青春期為11%～30%。2004～2013年間,中國0～12歲兒童睡眠障礙合并報(bào)告率為35.1%。我國老年人睡眠障礙發(fā)生率較高,約為20%～60%,且隨著年齡增加,呈不斷上升的趨勢(shì)[3]。

酸棗仁中化學(xué)成分主要包括皂苷、三萜類化合物、黃酮類化合物、生物堿類化合物,是臨床上中醫(yī)藥治療失眠癥狀的首選藥物[4],但實(shí)際應(yīng)用中劑量浮動(dòng)較大[5-10],效果也存在差異[11]。既往研究表明酸棗仁可延長果蠅睡眠總時(shí)間,同時(shí)片段化睡眠增強(qiáng)[12],并可顯著增加小鼠總睡眠和REM時(shí)間[13]。茶氨酸是茶葉中含有的一種特殊的非蛋白質(zhì)氨基酸,有著顯著的抗焦慮作用,可顯著提高大鼠腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的濃度。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)起到分子信號(hào)的作用,對(duì)癲癇、驚厥、帕金森病等多種精神疾病具有一定的療效。我國在2009年和2014年分別GABA和茶氨酸列入新食品原料[14-15]。酸棗仁、茶氨酸和GABA單獨(dú)使用均具有一定的改善睡眠作用,三者聯(lián)合使用效果未見報(bào)道。

因此,本文以小鼠為動(dòng)物模型,旨在探索酸棗仁提取物、茶氨酸、GABA復(fù)合配方的調(diào)節(jié)睡眠作用,為酸棗仁、茶氨酸和GABA的有效利用及改善睡眠保健產(chǎn)品的研發(fā)提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)Balb-c健康雄性小鼠 180只,8周齡,18～20 g,南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng);許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0001);酸棗仁提取物、茶葉茶氨酸、GABA 北京市營養(yǎng)源研究所提供;戊巴比妥鈉(純度>99%)、巴比妥鈉(>99%) Sigma公司提供;蒸餾水 廣東去城市食品飲料有限公司提供。

XS1003S型電子天平 瑞典Mettler Toledo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組 SPF級(jí)Balb-c健康雄性小鼠180只飼養(yǎng)于東南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,室溫(25±2) ℃,相對(duì)濕度55%±2%,12 h/12 h光照/黑暗,自由攝食和飲水。按體重分為3組,每組60只。各組件體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中第1組進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn);第2組進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn);第3組進(jìn)行巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn);以上實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行直接睡眠實(shí)驗(yàn)。因鼠類活動(dòng)夜間比白天活躍,因此動(dòng)物干預(yù)及實(shí)驗(yàn)開展均在夜間8點(diǎn)開展,消除動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài)變化對(duì)實(shí)驗(yàn)影響。

1.2.2 劑量設(shè)置 參考酸棗仁、茶氨酸、GABA文獻(xiàn)資料中單獨(dú)使用劑量[16-18],將復(fù)合配方人體每日攝入量設(shè)定569 mg/d(折算9.48 mg/kg·bw),其中為酸棗仁5.25 mg/kg·bw,(相當(dāng)于原藥材52.50 mg/kg·bw)、茶葉茶氨酸2.9 mg/kg·bw、GABA 1.33 mg/kg·bw。

復(fù)合配方以每日95、190、285 mg/kg·bw 3個(gè)劑量給予動(dòng)物,分別相當(dāng)于受試物人體攝入量的10、20、30倍。另設(shè)置蒸餾水作為對(duì)照組樣品。受試物每日蒸餾水配制,每日灌胃。

1.2.3 動(dòng)物干預(yù) 每組實(shí)驗(yàn)60只小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,實(shí)驗(yàn)前,稱量小鼠初始體重,并根據(jù)小鼠體重分為4組,分別是空白對(duì)照組(蒸餾水,20 mL/kg·bw)、低劑量組(95 mg/kg·bw)、中劑量組(190 mg/kg·bw)、高劑量組(285 mg/kg·bw),每組15只。各組動(dòng)物每天灌胃1次,持續(xù)灌胃干預(yù)30 d。每周測(cè)量一次小鼠體重,調(diào)整灌胃劑量。

1.2.4 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[19],動(dòng)物末次灌胃給予樣品30 min后,各組小鼠腹腔注射50 mg/kg·bw戊巴比妥鈉(i.p.)(小鼠100%入睡劑量,前期試驗(yàn)已驗(yàn)證),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡判定標(biāo)準(zhǔn),以小鼠翻正反射消失到恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間,比較受試物是否延長戊巴比妥鈉注射小鼠的睡眠時(shí)間。

1.2.5 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[19],動(dòng)物末次灌胃給予樣品30 min后,各組小鼠腹腔注射30 mg/kg·bw戊巴比妥鈉(i.p.)(小鼠10%～20%入睡劑量的閾下劑量),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡判定標(biāo)準(zhǔn),記錄30 min內(nèi)各組入睡動(dòng)物數(shù)并計(jì)算睡眠發(fā)生率。睡眠發(fā)生率(%)=(入睡動(dòng)物數(shù)/每組動(dòng)物數(shù))×100。比較受試物是否增加閾下劑量戊巴比妥鈉注射小鼠的睡眠發(fā)生率。

1.2.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn) 參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[19],動(dòng)物末次灌胃給予樣品20 min后,各組小鼠腹腔注射280 mg/kg·bw巴比妥鈉(i.p.)(小鼠100%入睡劑量),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡判定標(biāo)準(zhǔn),以小鼠注射巴比妥鈉到翻正反射消失的時(shí)間作為睡眠潛伏期,比較受試物能否縮短巴比妥鈉注射小鼠的睡眠潛伏期。

1.2.7 直接睡眠試驗(yàn) 各組動(dòng)物每天給予受試物,觀察灌胃后1 h內(nèi),小鼠是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象,以動(dòng)物的翻正反射消失超過60 s判為進(jìn)入睡眠,比較空白對(duì)照組和配方產(chǎn)品各劑量組對(duì)小鼠的直接催眠的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 改善睡眠配方對(duì)小鼠體重的影響

對(duì)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物干預(yù)前后動(dòng)物體重進(jìn)行分析。由圖1可知,實(shí)驗(yàn)前各組小鼠初始體重?zé)o明顯差異(P>0.05);灌胃給予不同劑量的配方7、14、21、30 d后,各組小鼠體重均無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠皮毛有光澤,飲食和活動(dòng)正常。給予樣品后,小鼠糞便濕潤程度適中,未見腹瀉和稀便等現(xiàn)象,表明配方產(chǎn)品在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量下對(duì)小鼠體重未造成明顯影響。

圖1 配方對(duì)小鼠體重的影響

2.2 配方對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[19],在戊巴比妥鈉催眠基礎(chǔ)上,若復(fù)合配方干預(yù)后小鼠睡眠時(shí)間延長,說明復(fù)合配方與戊巴比妥鈉有協(xié)同作用,結(jié)果見圖2,空白對(duì)照組小鼠睡眠時(shí)間為(33.87±4.98)min,復(fù)合配方低、中、高劑量組(95、190、285 mg/kg·bw)干預(yù)后睡眠時(shí)間為(38.79±4.40)、(39.67±4.10)、(41.93±5.44)min。與空白對(duì)照組比較,低、中、高劑量組小鼠睡眠時(shí)間分別延長14.53%、17.12%、23.80%,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。說明一定劑量的復(fù)合配方與戊巴比妥鈉具有協(xié)同作用,可以極顯著延長小鼠睡眠時(shí)間。

圖2 配方對(duì)戊巴比妥鈉處理的小鼠睡眠時(shí)間影響

2.3 配方對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

對(duì)復(fù)合配方進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn),研究其對(duì)小鼠睡眠發(fā)生率的影響,由于戊巴比妥鈉通過肝酶代謝,其誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的長短反映了肝酶的活性[20],而對(duì)該酶有抑制作用的藥物,也能延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。為排除這種影響,將戊巴比妥鈉劑量降至閾下劑量,即10%～20%小鼠入睡的劑量,進(jìn)行閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。

表1 小鼠戊巴比妥鈉注射后睡眠發(fā)生率比較

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出,空白對(duì)照組小鼠睡眠發(fā)生率為13.33%,符合本實(shí)驗(yàn)10%～20%的動(dòng)物入睡要求,說明30 mg/kg·bw可用于戊巴比妥鈉符合閾下劑量實(shí)驗(yàn)。低、中、高劑量組的睡眠發(fā)生率分別為33.33%、53.33%和73.33%,均高于空白對(duì)照組的睡眠發(fā)生率,且隨著劑量增加,睡眠發(fā)生率逐漸增加。與空白對(duì)照組相比,低劑量組的睡眠發(fā)生率增加卻不具有顯著性差異(P>0.05),中、高劑量組睡眠發(fā)生率顯著增加(P<0.05,P<0.01),且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明,復(fù)合配方與戊巴比妥鈉的協(xié)同睡眠作用并非通過影響戊巴比妥鈉的代謝過程而實(shí)現(xiàn)的。

2.4 配方對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

睡眠潛伏期即小鼠注射巴比妥鈉至翻正反射消失之間的時(shí)間,睡眠潛伏期越短說明樣品促進(jìn)睡眠效果越好。結(jié)果見圖3。巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)中,復(fù)合配方低、中、高劑量組(95、190、285 mg/kg·bw)干預(yù)后,小鼠睡眠潛伏期分別為(44.87±4.08)、(38.87±8.46)、(38.93±6.01) min,與空白對(duì)照比較,低、中、高劑量組睡眠潛伏期時(shí)間分別縮短12.48%、24.19%、24.07%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著劑量的增加,小鼠睡眠潛伏期也逐漸縮短,說明配方縮短小鼠睡眠潛伏期功效具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)合配方促進(jìn)小鼠入睡作用良好,隨著劑量增加,促進(jìn)入睡效果呈增強(qiáng)趨勢(shì),具有縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期的作用。

圖3 小鼠巴比妥鈉干預(yù)后睡眠潛伏期時(shí)間結(jié)果

2.5 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

通過30 d配方樣品干預(yù)觀察發(fā)現(xiàn),低、中、高劑量組小鼠睡眠只數(shù)均為0只,說明配方無直接睡眠作用。

從戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉催眠實(shí)驗(yàn)及巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,酸棗仁提取物、茶氨酸、GABA復(fù)合配方與戊巴比妥鈉、巴比妥鈉均具有較好的協(xié)同作用,即能夠促進(jìn)睡眠的發(fā)生,也有助于睡眠的維持。復(fù)合配方在95 mg/kg·bw劑量時(shí)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性,此時(shí),酸棗仁提取物、茶氨酸的劑量分別為52.29、29.05 mg/(kg·bw),當(dāng)劑量提升至190及285 mg/(kg·bw)時(shí),劑量亦遠(yuǎn)低于單獨(dú)使用有效劑量[16-18],三種原料具有協(xié)同作用。出現(xiàn)協(xié)同作用的原因可能是a. 在成分上，酸棗仁和GABA均與谷氨酸代謝密切相關(guān)。劉靜等[21]對(duì)酸棗仁蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明酸棗仁蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%(干重)，其中18種常見氨基酸中，谷氨酸含量最高，占種氨基酸的30.95%；GABA是谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下形成的，屬于谷氨酸的結(jié)構(gòu)類似物；在結(jié)構(gòu)上，茶氨酸屬于酰胺類化合物，和GABA在結(jié)構(gòu)也具有一定的相似性，從而導(dǎo)致其功能相近[22]。b. 在改善睡眠生理功能方面， 酸棗仁影響大腦皮質(zhì)代謝性谷氨酸受體的表達(dá),調(diào)節(jié)谷氨酸的釋放[23],促進(jìn)GABA合成,抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸的過多活躍[24],同時(shí)可提高調(diào)節(jié)大鼠海馬中5-T1AR和5-HT2AR的表達(dá)[25],改善睡眠狀態(tài);茶氨酸可促進(jìn)大腦表面α波產(chǎn)生,使人體產(chǎn)生舒適愉悅的感覺;GABA在促進(jìn)α波產(chǎn)生的同時(shí)抑制β波的產(chǎn)生,具有鎮(zhèn)靜大腦降低壓力的作用[26],三者在生理上具有協(xié)同效應(yīng)[15]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究通過延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)和直接睡眠實(shí)驗(yàn)研究了酸棗仁提取物、茶氨酸。GABA復(fù)合配方的改善睡眠作用。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》[19],延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性,即可判定受試物具有改善睡眠的功效。本研究顯示,復(fù)合配方具有改善睡眠功效且效果隨劑量增加而升高。

本次研究的主要依據(jù)為《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》,根據(jù)其實(shí)驗(yàn)要求證實(shí)了酸棗仁提取物、茶氨酸、GABA復(fù)合配方具有改善睡眠的功效,指標(biāo)檢測(cè)主要集中于動(dòng)物行為學(xué)的觀察,三種原料復(fù)合使用在神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、激素、肽類等方面的共同作用有待于進(jìn)一步深入研究。