崔 霖, 朱建星, 張萬忠, 于海龍

(1. 沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院, 沈陽 110142;2. 松桃苗族自治縣民族中醫(yī)院, 貴州 銅仁 554100)

0 引 言

虎杖(Polygonum cuspidatum),又名山茄子,金鎖王等[1],是人們比較熟悉的中草藥,可入藥的部分主要是根和莖。因其中含有黃酮類、二苯乙烯類等許多成分[2-3],具有很高藥用價值。白藜蘆醇(Resveratrol,以下簡稱Res),是其中含量最多化合物之一,屬于二苯乙烯類化合物[4]。具有復(fù)雜的生物成分,能抑癌、防氧化、消炎、抑菌[5]、降脂減肥、預(yù)防心血管和肝臟損傷,普遍用于食品藥品、補(bǔ)充劑、外用護(hù)膚品范圍,用途十分廣泛。

現(xiàn)在從虎杖中提取并純化Res的工藝比較繁多[6-12],提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶解提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取等,純化方法主要有溶劑萃取法、大孔樹脂吸附法、雙水相萃取法、柱層析法、高速逆流色譜法等,結(jié)合實驗環(huán)境和實驗室條件,綜合考慮本實驗采用乙醇回流法和超聲波輔助法從虎杖中提取Res,用Res的提取率為響應(yīng)變量,開展單因素實驗和正交實驗,分析并作出工藝條件的改進(jìn)。Res粗品通過乙醚溶劑萃取進(jìn)行初步純化,比較純化前后Res的含量,再以其含量及回收率為研究對象,對大孔樹脂吸附法純化Res的工藝作改進(jìn)實驗。

1 實驗材料與設(shè)備

虎杖(優(yōu)質(zhì),西安善益堂藥業(yè)有限公司)、稱量紙(10 cm×10 cm鄭州中天實驗儀器有限公司)、無水乙醇(分析純,無錫三合化工有限公司)、Res標(biāo)準(zhǔn)品(分析純,中國藥品生物制品鑒定所)、AB-8樹脂(河北樹脂工藝品生產(chǎn)廠)。

電子天平(FA22048沈陽拓宇衡器有限公司)、高速萬能粉碎機(jī)(FW100 武漢華威化工儀器有限公司)、紫外∕可見分光光度計(UV1100翱藝儀器(上海)有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ武漢華威化工儀器有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000B鄭州生化儀器有限公司)、恒溫水浴鍋(HH-4遼寧賽亞斯科技有限公司)、數(shù)控型超聲波清洗器(KQ5200DE鄭州生化儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 乙醇回流法單因素實驗

將虎杖粗品經(jīng)粉碎機(jī)打碎、篩濾得虎杖粉末。通過單因素實驗,探究不同因素對提取率的作用,然后以4種不同因素作為變量:1) 乙醇濃度:取5份5.0 g虎杖粉末,對應(yīng)放入燒瓶中,分別加入質(zhì)量濃度為50%、60%、70%、80%、90%的50 mL乙醇,配置料液比為1∶10的虎杖-乙醇溶液,并充分搖勻。再在85 ℃水浴下,熱回流2次,時間為2 h,合并2次的提取液,迅速利用循環(huán)水式真空泵抽濾后,得到提取液。將其分別用各自濃度乙醇定容至100 mL,取1 mL稀釋1 000倍,在波長306 nm處測定Res的吸光值,以此計算Res濃度和提取率。2) 料液比:以料液比作為唯一變量,分別加入質(zhì)量濃度為80%的乙醇25、50、75、100、125 mL,即原料與溶劑比例1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25。再按如上方法測定計算Res濃度和提取率。3) 回流時間:加入質(zhì)量濃度為80%的乙醇溶液50 mL(原料與溶劑比例為1∶10),在85 ℃水浴下熱回流2次,回流時間分別為1、2、3、4、5 h,再按如上方法測定計算Res濃度和提取率。4) 回流次數(shù):加入質(zhì)量濃度為80%的乙醇溶液50 mL(原料與溶劑比例為1∶10),分別在85 ℃水浴下熱回流1、2、3、4、5次,回流時間均為2 h,再按如上方法測定計算Res濃度和提取率。設(shè)計正交實驗,如表1所示。

表1 乙醇回流法提取Res正交實驗因素水平Table 1 Horizontal design of orthogonal experimental factors for extracting Res by ethanol reflux method

2.2 超聲波輔助提取法單因素實驗

通過單因素實驗,探究不同因素對提取率的作用,以4種不同因素作為變量:

1) 乙醇濃度:取5份5.0 g虎杖粉末,對應(yīng)放入250 mL錐形瓶中,加入質(zhì)量濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液100 mL(原料與溶劑比例為1∶20),并充分搖勻。在超聲波清洗器中進(jìn)行提取,溫度恒定設(shè)為60 ℃,功率140 W,提取60 min,計算Res的濃度和提取率。2) 料液比:加入原料與溶劑比例分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的虎杖-乙醇溶液,并充分搖勻,按2.1(1)方法計算Res濃度和提取率。3) 超聲功率:設(shè)定超聲功率分別為80、100、120、140、160 W,按原料與溶劑比例1∶20加入質(zhì)量濃度為80%的乙醇溶液(100 mL),充分搖勻,溫度恒定設(shè)為60 ℃,提取60 min。按2.1(1)方法計算Res濃度和提取率。4) 提取時間:設(shè)定提取時間分別為40、50、60、70、80 min,按原料與溶劑比例1∶20加入質(zhì)量濃度為80%的乙醇溶液(100 mL),充分搖勻,溫度恒定設(shè)為60 ℃,功率140 W。按2.1(1)方法計算Res濃度和提取率。設(shè)計正交實驗,如表2所示。

表2 超聲波輔助法提取Res因素水平Table 2 Factor level design of Res extraction by ultrasonic assisted method

2.3 白藜蘆醇提取率的計算

提取率P的計算,如計算公式(1):

(1)

式中,n為稀釋的倍數(shù);V為提取液的體積(mL);C為提取液的Res含量(μg/mL);W為虎杖粉末的質(zhì)量(g)。

2.4 虎杖中白藜蘆醇的純化

2.4.1 溶劑萃取純化

先采用醇沉除雜對Res提取液進(jìn)行預(yù)處理,再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將其進(jìn)行濃縮,以濃縮液無醇味為提取終點。向濃縮液中加入等體積比乙醇,將pH調(diào)節(jié)至2.0,靜置15 h后,減壓抽濾,得Res的粗提液[13-14]。

再用鹽酸將Res粗提液的pH調(diào)至中性,減壓濃縮,將經(jīng)乙酸乙酯萃取3次的濃縮液上層液合并,經(jīng)活性炭脫色、真空干燥,得到Res粗品,計算Res含量與收率。

ω=C×n×1 000

(2)

式中,ω為Res含量(mg/mL);C為Res質(zhì)量濃度(μg/mL);n為稀釋倍數(shù)。

(3)

式中α為Res純度%;m1為純化后粗品溶解液中Res質(zhì)量(mg);m2為純化后Res粗品質(zhì)量(mg)。

(4)

式中,η為Res收率%;m3為純化后Res的質(zhì)量(mg);m4為純化前Res的質(zhì)量(mg)。

2.4.2 大孔吸附樹脂純化

將超聲波清洗器制備的Res提取液萃取干燥,成品加蒸餾水溶解,得上柱液。先把AB-8樹脂進(jìn)行預(yù)處理[15],再把準(zhǔn)備好的液上柱進(jìn)行吸附(流速1 mL/min,循環(huán)2 h)。結(jié)束后,洗脫至中性,然后用70%質(zhì)量濃度乙醇,將Res從柱上洗脫下來,隔5 min收集1次,測其吸光度值,作Res解析曲線,合并洗脫,并液,測量Res含量。然后進(jìn)行減壓濃縮,烘干即為Res化合物。

3 結(jié)果與分析

3.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱量5 mg的Res標(biāo)準(zhǔn)品,用無水乙醇定容至25 mL,可得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液。然后吸取1 mL,定容至25 mL,即可得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.008 mg/mL)。再依次吸取其溶液0、1、2、3、4、5 mL用無水乙醇溶解,定容至10 mL,得到質(zhì)量濃度分別為0、0.000 8、0.001 6、0.003 2、0.004 0 mg/mL的Res標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用無水乙醇做比對,測定每份樣品在波長為306 nm處的吸光值,做2組平行實驗,取2組實驗平均值。建立吸光度A對樣品濃度C(mg/mL)的線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1和表3。

圖1 Res標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Res standard curve

表3 實驗數(shù)據(jù)Table 3 Experimental data

回歸方程為

A=0.099 5C+0.380 2、R2=0.997 3

(5)

3.2 乙醇回流法不同因素對提取率的影響

3.2.1 單因素對白藜蘆醇提取率的影響

1) 乙醇濃度:按照2.2.1(1)的方法進(jìn)行處理,結(jié)果如圖2。

圖2 乙醇濃度的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration

2) 回流時間:按照2.2.1(2)的方法進(jìn)行處理,結(jié)果如圖3。

圖3 回流時間的影響Fig.3 Effect of reflux time

3) 回流次數(shù):按照2.2.1(3)的方法進(jìn)行處理,結(jié)果如圖4。

圖4 回流次數(shù)的影響Fig.4 Effect of reflux times

4) 料液比:按照2.2.1(4)的方法進(jìn)行處理,結(jié)果如圖5。

圖5 料液比的影響Fig.5 Effect of material liquid ratio

由上圖分析得,濃度70%時提取率達(dá)到波峰,其他值皆不理想。提取率與回流時間正相關(guān),2 h后斜率突然變小。線性曲線變化趨勢為先上升,提取2次后曲線趨于平穩(wěn)。只有1∶10的原料與溶劑比例才可以將Res充分提取出來,除此之外效果都不理想,乙醇用量越多,溶解的雜質(zhì)越多,導(dǎo)致提取率下降。由此可得,原料與溶劑比例1∶10,提取的Res最多。

3.2.2 正交實驗結(jié)果

以提取率為響應(yīng)參考,設(shè)計正交實驗,正交實驗結(jié)果如表4,方差分析表見表5。

表4 正交實驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment

表5 正交實驗方差分析表Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiment

由表4得,各變量對Res的提取率都有一定的作用,但強(qiáng)弱不一:A>B>C>D,其中最優(yōu)條件為A2B2C3D3,即用70%濃度乙醇,1∶10的原料與溶劑比例時,每次2 h的回流3次。采用最優(yōu)條件驗證結(jié)果,其提取率達(dá)1.30%,好于之前結(jié)果,證明此工藝優(yōu)化良好。

3.3 超聲波提取不同因素對提取率的影響

3.3.1 單因素對白藜蘆醇提取率的影響

1) 乙醇濃度:按照2.2.3(1)的方法對虎杖中Res進(jìn)行超聲浸提,測所得提取液吸光度值,計算Res提取率,繪制坐標(biāo)圖,結(jié)果見圖6。

圖6 乙醇濃度的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration

2) 提取時間:按照2.2.3(2)的方法對虎杖粉末進(jìn)行超聲浸提,測提取液吸光度值,計算Res提取率,繪制坐標(biāo)圖,結(jié)果見圖7。

圖7 提取時間的影響Fig.7 Effect of extraction time

3) 超聲波清洗器功率:按照2.2.3(3)的方法對虎杖粉末進(jìn)行超聲浸提,測提取液吸光度值,計算Res提取率,繪制坐標(biāo)圖,結(jié)果見圖8。

圖8 超聲功率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic power

4) 料液比:按照2.2.3(4)的方法對虎杖粉末進(jìn)行超聲浸提,測提取液吸光度值,計算Res提取率,繪制坐標(biāo)圖,結(jié)果見圖9。

圖9 料液比的影響Fig.9 Effect of material liquid ratio

由圖6可知,線性曲線趨勢先升后降,也為提取率變化趨勢,濃度低時,效果不理想,過高也不利于Res溶出,最佳條件80%。由圖7可知,線性曲線變化趨勢是先增大,提取時間60 min后曲線趨于平穩(wěn)。由圖8可知,功率120 W時提取率達(dá)到波峰,其他值皆不理想。由圖9可知,原料與溶劑比例為1∶25時Res提取率接近峰值。

3.3.2 正交實驗結(jié)果

以提取率為響應(yīng)參考,設(shè)計正交實驗,正交實驗結(jié)果如表6,方差分析表見表7。

表6 正交優(yōu)化實驗結(jié)果Table 6 Experimental results of orthogonal optimization

表7 正交優(yōu)化實驗方差分析Table 7 Analysis of variance of orthogonal optimization experiment

通過上表的分析,實驗中選定的變量對Res提取率影響存在差異,強(qiáng)弱為:A>D>B>C。當(dāng)變量為A2B2C2D3時最佳,此時乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%,原料與溶劑比例1∶28,在超聲波清洗器的功率為120 W的條件下提取60 min。其中變量A的影響效果顯著,即乙醇濃度為影響作用最強(qiáng)的變量,符合正交結(jié)果。在A2B2C2D3因素下驗證其結(jié)果,結(jié)果Res的提取率可以達(dá)到1.36%,好于之前結(jié)果,該工藝優(yōu)化良好。

3.4 分離純化實驗

圖10 Res洗脫曲線Fig.10 Res elution curve

3.4.1 溶劑萃取法分離純化

分別使用以上2種方法確定的最佳優(yōu)化工藝進(jìn)行萃取。乙醇回流法得粗品88.25 mg,純度60.04%;超聲波輔助法得粗品76.37 mg,純度74.98%。

3.4.2 大孔吸附樹脂分離純化

經(jīng)減壓后所得濃縮洗脫液中的Res含量為1.65 mg/mL,純度由51.02%升至89.07%,純化后得到干燥的Res化合物61.13 mg,收率95.09%。Res洗脫曲線如圖10所示。

4 結(jié) 論

室溫條件下,用乙醇回流法提取白藜蘆醇,最佳工藝條件為70%濃度乙醇,原料與溶劑比例1∶10,回流3次,每次2 h,此時白藜蘆醇提取率達(dá)1.30%。室溫條件下,用超聲波輔助法提取白藜蘆醇的最佳工藝條件為80%濃度乙醇,原料與溶劑比例1∶28,在超聲功率120 W的條件下浸提60 min,此時白藜蘆醇提取率達(dá)1.36%。經(jīng)過萃取和大孔樹脂吸附后,能夠使目標(biāo)產(chǎn)物純度提高明顯,表明應(yīng)用大孔樹脂可對虎杖中白藜蘆醇進(jìn)行有效的純化。