溫志浩，盧健棋，潘朝鋅，何新兵，王慶高，黃明劍，彭志林，龐 延，周宇楨，黃舒培

目前我國冠心病的一級和二級預防還做得遠遠不夠[1]，很多病人在確診冠心病時冠狀動脈病變已經(jīng)非常嚴重，彌漫病變和多支病變不在少數(shù)，喪失了介入治療或手術治療的時機，現(xiàn)有藥物治療亦無法有效改善心肌缺血，成為目前治療的難點。此外，目前介入治療費用較高，很多病人難以負擔?；谖覈鴩?，找到一種既能有效改善病人癥狀和預后，又能獲得較高衛(wèi)生經(jīng)濟學收益的辦法是非常有必要的。目前的研究重點集中在刺激缺血心肌血管生成方面，即促進冠狀動脈側支循環(huán)建立，改善缺血心肌血供。不過目前存在促血管新生作用不理想及血管新生相關副作用的研究瓶頸[2]。中醫(yī)辨證論治在促血管新生方面具有一定的優(yōu)勢，臨床研究認為氣虛、陽虛、血瘀是引起冠心病發(fā)生發(fā)展的重要因素，既往的研究也提示益氣、通陽、活血藥對促血管新生有獨特的作用[3-4]?；诖?，本研究旨在利用高脂飲食和冠狀動脈結扎法造成兔動脈粥樣硬化和急性心肌梗死雙模型[5]，觀察不同組方的安心顆粒對急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)兔梗死邊緣區(qū)心肌微血管密度的影響，并同步測定動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管密度等副反應指標，從整體和微觀層次來闡述益氣活血通陽法對心肌梗死兔心臟的促血管新生作用及其副反應的發(fā)生情況，為益氣活血通陽法促進缺血心肌血管新生提供科學依據(jù)，并為平衡促血管新生作用和血管新生相關副反應提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康雄性新西蘭兔50只，2月齡，體重2.7～3.0 kg，購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物合格證編號：45000300000676，許可證編號：scxk(桂)2014-0002。

1.2 主要實驗試劑及儀器 Envision試劑(HRP/Rabbit)即用型(Dako，丹麥)；CD34單克隆抗體(santacruz，美國)；醫(yī)學圖像分析軟件(申騰信息技術有限公司，上海)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備

1.3.1.1 復制動脈粥樣硬化動物模型 健康雄性新西蘭兔50只，按體重隨機編入各組，每組5只。單籠飼養(yǎng)，第1周先予普通飼料喂養(yǎng)，以適應周圍環(huán)境。后給予高脂飲食喂養(yǎng)，每只150 g/d，連續(xù)喂養(yǎng)8周，復制動脈粥樣硬化動物模型。

1.3.1.2 復制急性心肌梗死和動脈粥樣硬化動物雙模型 隨機選取高脂飲食第2周末的動物，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg注入耳緣靜脈麻醉后仰臥位固定在兔臺上，氣管插管連接小動物呼吸機，胸前區(qū)備皮、消毒、鋪巾，沿左胸骨旁線劃開皮膚后逐層鈍性分離組織，分離至肋骨層面后在胸骨旁線處剪斷第2、3肋骨，撐開器充分暴露視野，找到縱隔后小心剪開心包，將心包固定在胸壁上，找到心臟前室間溝，用3號外科縫線于前室間溝上1/3處結扎前降支血管，結扎遠端心肌顏色由淡紅變蒼白，搏動幅度減弱，30 min后剪斷結扎線，逐層關閉胸腔，待動物恢復自主呼吸，拔除氣管插管，肌內(nèi)注射青霉素預防感染。術后第3天沿原開口開胸，觀察見心臟較前變大，搏動明顯減弱，取出心臟，固定后行病理切片HE染色。顯示急性心肌梗死復制成功。

1.3.2 給藥方案 安心顆粒組方：紅參10 g，水蛭10 g，桂枝12 g，瓜蔞殼12 g，茯苓10 g等。紅參、水蛭用乙醇提取，其余藥物用水提取。參考基線等比增減設計法，按照7種比例(10∶0、10∶4、10∶7、10∶10、7∶10、4∶10、0∶10)稱取紅參、水蛭，按照前期經(jīng)過正交試驗設計得到的最佳提取方案進行提取，即70%乙醇提取，每次提取1.5 h，提取3次，每次10倍量乙醇，合并乙醇提取液，回收乙醇至盡，置于蒸發(fā)皿中水浴濃縮，合并水提部分，定容后備用；安心顆粒連續(xù)給藥10周，給藥劑量按兔與人體表面積折合換算。

1.3.3 實驗分組 空白組：正常飲食，予生理鹽水灌胃。假手術組：正常飲食，只開胸穿線，不結扎左冠狀動脈前降支，術后給予生理鹽水灌胃。模型組：高脂飲食，行結扎前降支術后給予生理鹽水灌胃。西藥對照組：于開胸結扎冠狀動脈后立即在結扎處周圍噴灑堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。中藥組：亞組1～亞組7術后分別給予紅參/水蛭比例為10∶0、10∶4、10∶7、10∶10、7∶10、4∶10、0∶10的安心顆粒灌胃液。

1.4 取材 缺血心肌標本取材：將心臟沿短軸水平橫切，于梗死邊緣區(qū)切取組織標本，置入10%中性甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。動脈標本取材：取胸主動脈橫截取材，常規(guī)固定包埋。

1.5 檢測 采用En Vision法[6]行CD34免疫組化染色測定CD34陽性反應強度及新生血管密度，陽性反應強度=陽性反應面積/平均光密度。染色呈棕黃色為陽性，參照Kaku等[7]介紹的方法，在低倍鏡下選擇CD34標記的新生血管密度高的區(qū)域，100倍鏡下計數(shù)3個視野，取其平均值，管腔>8個紅細胞直徑的血管不計在內(nèi)。

2 結 果

2.1 各組心肌組織不同區(qū)域新生血管密度比較 模型組和西藥對照組缺血心肌區(qū)新生血管密度大于梗死心肌區(qū)和正常心肌區(qū)(P<0.05)；在缺血心肌區(qū)，紅參與水蛭比例10∶4組與西藥對照組新生血管密度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，優(yōu)于其他比例中藥組及模型組(P<0.05)，說明紅參、水蛭比例為10∶4能夠更有效地促進缺血心肌區(qū)的血管新生。詳見表1。

表1 各組心肌組織不同區(qū)域新生血管密度比較 (±s) 單位：根/mm2

2.2 各組心肌組織不同區(qū)域CD34陽性反應強度比較 模型組和各用藥組缺血心肌區(qū)CD34陽性反應強度大于梗死心肌區(qū)和正常心肌區(qū)(P<0.05)，說明缺血心肌區(qū)的血管新生密度較為密集。在缺血心肌區(qū)，紅參與水蛭比例10∶4組與西藥對照組CD34陽性反應強度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，10∶4中藥組與西藥對照組優(yōu)于模型組(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌組織不同區(qū)域CD34陽性反應強度比較 (±s)

2.3 各組主動脈壁區(qū)CD34陽性反應強度比較 各組主動脈壁區(qū)CD34陽性反應強度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組第10周主動脈CD34陽性反應強度比較 (±s)

3 討 論

近年來，冠心病在我國的發(fā)病率呈逐漸升高態(tài)勢[8]。隨著冠心病發(fā)病年齡的年輕化，其造成的社會經(jīng)濟和衛(wèi)生負擔也越來越大。由此，冠心病的治療受到了國內(nèi)外的廣泛關注。臨床治療指南不斷推出和更新，血運重建治療技術不斷發(fā)展，但基于我國目前國情，許多病人仍難以承受介入治療的藥物及器械相關費用，且部分病人由于血管條件或基礎病等原因無法實行介入或冠狀動脈搭橋等血運重建治療。因此，尋求更為經(jīng)濟的冠心病血運修復策略是臨床實踐迫切需要的。

基于上述認識，采取了包括蛋白治療、基因治療、細胞治療和聯(lián)合治療等方法以實現(xiàn)治療性血管再生[2]，關于血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGFs)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)和內(nèi)皮祖細胞等研究日益增多。目前雖然很多一期試驗得到了肯定的結論[9]，但近年的二期臨床試驗卻沒有得到陽性結果[10]，且還暴露了包括促動脈狹窄、形成不穩(wěn)定斑塊、促腫瘤生長、視網(wǎng)膜增生等多種副作用[11]。有科學家就此提出了“Janus Phenomenon”的概念，即具有促血管新生作用的藥物同樣具有加重動脈粥樣硬化的作用[12]，這是治療上廣受關注的一個矛盾點。故尋找具有肯定促血管新生作用而沒有相關副作用的藥物，已經(jīng)成為當今心血管研究的重大課題。

益氣通陽、活血通脈成為冠心病的重要治療法則。而進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些治療方法對血管新生的多個環(huán)節(jié)均有作用。有研究顯示：人參、三七提取物可促進血管生成信號通路上VEGF R-2的表達[13]；而復方芪丹液則被發(fā)現(xiàn)能夠持續(xù)上調促VEGF、bFGF的基因與蛋白的表達，提高缺血心肌毛細血管密度[14]。近年來，許多實驗研究證明，活血化瘀法能通過調節(jié)血脂代謝、抑制血管平滑肌增生和遷移、保護血管內(nèi)皮細胞等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮減輕動脈粥樣硬化病變和穩(wěn)定斑塊的作用[15-16]。由此，通過益氣藥和活血藥的合理配伍，可能會為“Janus Phenomenon”提供解決方案。

安心顆粒是全國名老中醫(yī)方顯明教授研制的驗方，已于臨床上應用多年，由人參、桂枝、瓜蔞、水蛭、茯苓等中藥制成，方中人參大補元氣、安神益心為君；桂枝通陽行脈、助陽化氣，為臣藥；水蛭活血逐瘀、通脈散結；瓜蔞理氣寬胸、化痰泄?jié)?，同為佐藥；茯苓益心、脾，寧心安神，為使藥。諸藥合用共奏甘溫益氣、活血通陽之功效。前期研究表明，安心顆?？擅鞔_改善心肌缺血癥狀，減少冠心病介入術后不良心血管事件的發(fā)生[17]。實驗研究則提示安心顆粒對大鼠心肌缺血再灌注損傷有顯著的保護作用[18]，并可抑制粥樣硬化斑塊形成[19]。現(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷Rgl可動員骨髓干細胞歸巢于缺血心肌，有效促進微血管形成，通過上調VEGF及其受體的表達，促進血管再生，促進缺血心臟功能恢復[20]；瓜蔞能擴張冠狀動脈，改善心肌缺血狀態(tài)。此外，另有研究顯示，水蛭不僅可以促進血管新生[21]，也可降低經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后再狹窄發(fā)生率[22]。

本實驗研究利用高脂飲食和冠狀動脈結扎法造成兔動脈粥樣硬化和急性心肌梗死雙模型，觀察不同組方的安心顆粒對急性心肌梗死兔梗死邊緣區(qū)心肌新生微血管密度的影響，并同步測定動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD34反應強度等副反應指標，結果提示，安心顆粒中藥干預組中，紅參與水蛭比例為10∶4中藥組可顯著增加缺血心肌區(qū)新生血管密度，10∶4中藥組CD34陽性反應強度顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與西藥對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而同時在主動脈壁區(qū)CD34反應強度未見升高。故考慮益氣活血藥物的合理配比可促進梗死邊緣區(qū)血管新生，同時未見導致動脈斑塊內(nèi)血管新生的副作用。