王軒，周健*，明紅梅，張宿義，李德林，羅杰，俞飛

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢,643000) 2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州,646000)

瀘型酒是濃香型白酒的典型代表，是以泥窖為發(fā)酵容器、中溫大曲作為糖化發(fā)酵劑、高粱等谷物作為釀酒原料，經(jīng)續(xù)糟配料、開放式操作生產(chǎn)、多菌密閉共酵、常壓固態(tài)甑桶蒸餾和陳釀勾兌等釀制工藝釀造而成的，以己酸乙酯為主體香味物質(zhì)的白酒[1]。在傳統(tǒng)濃香型白酒釀造中，多數(shù)生產(chǎn)活動(dòng)屬于人力生產(chǎn)，其勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)效率低，并且釀造環(huán)境衛(wèi)生條件與食品生產(chǎn)環(huán)境要求差距較大[2]。近年來(lái)，伴隨著生產(chǎn)成本不斷攀升，能源短缺的形勢(shì)也越嚴(yán)重，因此，白酒產(chǎn)業(yè)急需轉(zhuǎn)型升級(jí)，提高釀造環(huán)節(jié)中機(jī)械化程度，節(jié)省人力和時(shí)間，對(duì)于白酒企業(yè)提高效率和降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

隨著機(jī)械化釀酒設(shè)備的應(yīng)用和普及，濃香型白酒生產(chǎn)的機(jī)械化程度也越來(lái)越高。目前研究表明，在濃香型白酒生產(chǎn)中，機(jī)械化配料可以替代手工配料[3-4]；機(jī)械裝甑與人工裝甑的酒糟比較，出酒率無(wú)顯著差異，機(jī)械裝甑的優(yōu)級(jí)酒比例以及己酸乙酯提取率均優(yōu)于手工裝甑[5-6]；而攤晾機(jī)的使用，可以使其入窖糟醅的穩(wěn)定性優(yōu)于地?cái)偭篮蛿偭来瞇7]。但是到目前為止，還缺少針對(duì)機(jī)械與手工2種釀造方式下各生產(chǎn)環(huán)節(jié)中酒糟理化指標(biāo)系統(tǒng)性分析，以及這2種釀造方式下酒糟風(fēng)味物質(zhì)變化探究。

在已有研究基礎(chǔ)上，本文對(duì)機(jī)械與手工2種釀造方式下，各生產(chǎn)環(huán)節(jié)中酒糟理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律及差異性進(jìn)行研究，從而為濃香型白酒機(jī)械化釀造找到實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步改進(jìn)機(jī)械化釀酒工藝和提升基酒品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣本：酒糟，某酒企；取樣：2種釀造方式均按照濃香型白酒生產(chǎn)工藝要求來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)，機(jī)械釀造在潤(rùn)糧、拌料、上甑和打量水環(huán)節(jié)均采用機(jī)械設(shè)備；手工釀造在潤(rùn)糧、拌料、上甑和打量水環(huán)節(jié)均由人工操作；攤晾、下曲均為一體式機(jī)械設(shè)備；機(jī)械釀造車間窖池修建于1970～1980年，手工釀造車間窖池修建自清末民初。2個(gè)車間各選1口正常發(fā)酵的窖池，取目的窖池酒糟在出甑、打量水、攤晾和下曲入窖環(huán)節(jié)中的樣本，待入窖發(fā)酵45 d后開窖，取出窖、拌料上甑和出甑環(huán)節(jié)中的酒糟樣本。取樣信息見表1。

表1 取樣信息表Table 1 Sampling information table

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、酒石酸鉀鈉、NaOH、酚酞、重鉻酸鉀、無(wú)水乙醇、CH2Cl2等,均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；2-辛醇,色譜純,成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

DHG-9240電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CP114電子天平、STO210 pH計(jì)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；EV2424ST干式氮吹儀，德國(guó)WIGGENS公司；Agligent 6890 N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 酒糟理化指標(biāo)測(cè)定

對(duì)酒糟樣本理化指標(biāo)中水分含量、酸度濃度、淀粉濃度和酒精度進(jìn)行測(cè)定，參考文獻(xiàn)[1,8]，其中水分含量測(cè)定采用常壓105 ℃烘箱干燥法；酸度采用酸堿滴定法；酒精度采用重鉻酸鉀氧化法；淀粉濃度測(cè)定采用斐林試劑法。各數(shù)據(jù)均為目的窖池對(duì)應(yīng)樣本3次檢測(cè)的平均值。

1.4.2 酒糟揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性與半定量分析

酒糟前處理：稱取10 g酒糟，研磨后裝入50 mL離心管中，加入CH2Cl220 mL，恒溫超聲振蕩20 min，重復(fù)該步驟3次，收集萃取液后加入50 μL質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL的內(nèi)標(biāo)2-辛醇和5 g無(wú)水Na2SO4，4 ℃靜置12 h去除水分。將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮至5 mL，再氮吹至1 mL，用0.22 μm有機(jī)相濾器過(guò)濾后直接進(jìn)樣。氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)條件參考文獻(xiàn)[9]。

定性與半定量分析：檢出揮發(fā)性組分物質(zhì)的質(zhì)譜圖，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(NIST05a.L和RTLPEST3.L)對(duì)比鑒定，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和有效性，結(jié)合匹配度>90%、特征離子及輔助人工圖譜解析來(lái)進(jìn)行定性分析。采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行計(jì)算，得到的各物質(zhì)的量為內(nèi)標(biāo)的相對(duì)含量[10]。

1.4.3 酒糟特征香氣成分分析

采用香氣活度值(odor activity value,OAV)表征酒糟中香氣化合物對(duì)主體香氣成分的貢獻(xiàn)，當(dāng)OAV>1時(shí)，推測(cè)該香氣成分對(duì)樣品香氣的直接貢獻(xiàn)和影響較大[9]。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，顯著性界值P<0.05，從而判斷數(shù)據(jù)差異；數(shù)據(jù)圖采用Origin繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒糟理化指標(biāo)分析

將酒糟樣本進(jìn)行理化檢測(cè)分析后，結(jié)果見圖1。

在濃香型白酒生產(chǎn)中，控制適宜的入窖工藝參數(shù)，如水分含量、酸度濃度和淀粉濃度是生產(chǎn)的關(guān)鍵點(diǎn)之一[4]。水是釀酒生產(chǎn)活動(dòng)的必須條件之一，2種生產(chǎn)方式下酒糟通過(guò)打量水后水分含量顯著增加，其中手工釀造和機(jī)械釀造酒糟在打量水環(huán)節(jié)時(shí)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為61.72%和55.88%，兩者差異顯著(P<0.05)，通過(guò)攤晾、下曲后水分含量有所降低。由瀘型酒技藝大全可知，酒糟在入窖時(shí)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在52%～56%[1]。手工釀造和機(jī)械釀造酒糟在入窖時(shí)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為57.20%和52.91%，出窖時(shí)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為62.31%和59.33%，兩者差異顯著(P<0.05)。

a-水分;b-酸度;c-淀粉;d-酒精度圖1 各生產(chǎn)操作環(huán)節(jié)酒糟理化指標(biāo)Fig.1 Physical and chemical indexes of distiller’s grain in all production and operation links 注：不同操作環(huán)節(jié)中小寫字母不同表示差異顯著；相同操作環(huán)節(jié)大寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

適當(dāng)酸度可以抑制雜菌生長(zhǎng)，有利于糊化、糖化作用，由瀘型酒技藝大全可知,酒糟入窖酸度控制在1.2～1.9 mmol/10 g[1]。2種生產(chǎn)方式下，手工釀造和機(jī)械釀造中酒糟入窖酸度濃度分別為1.92和1.83 mmol/10 g；隨著發(fā)酵結(jié)束，出窖時(shí)酸度濃度顯著增加，分別為3.43和3.18 mmol/10 g，兩者差異顯著(P<0.05)。通過(guò)拌料后酸度分別為2.47和2.32 mmol/10 g，分別下降了27.99%和27.04%，蒸餾后與出窖酒糟相比下降了42.86%和40.56%。

淀粉提供微生物營(yíng)養(yǎng)成分和發(fā)酵能量，入窖淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)在16%～22%[1]。手工釀造和機(jī)械釀造中酒糟入窖淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.14%和17.83%；出窖時(shí)酒糟殘淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.91%和11.44%，兩者差異顯著(P<0.05)。

發(fā)酵質(zhì)量好的酒糟出窖時(shí)酒精度應(yīng)在4%～6%[1]。手工釀造和機(jī)械釀造入窖酒糟酒精度積分?jǐn)?shù)為0.05%和0.03%；隨著發(fā)酵結(jié)束，其出窖酒糟中酒精度分別為5.14%和4.49%，兩者差異顯著(P<0.05)；出窖酒糟通過(guò)拌料后酒精度分別為3.44%和3.02%，分別下降了33.07%和32.74%。

通過(guò)對(duì)2種生產(chǎn)方式各環(huán)節(jié)中酒糟理化指標(biāo)分析后，可以看出機(jī)械釀造中入窖酒糟均在規(guī)定參數(shù)范圍內(nèi)，手工釀造下入窖水分含量與酸度濃度略高于參數(shù)范圍，可能是工人師傅操作和拌料不均勻?qū)е耓3,11]。在2種生產(chǎn)方式中，入窖時(shí)水分含量存在顯著差異外，酸度濃度、淀粉濃度和酒精度無(wú)顯著差異(P>0.05)；出窖時(shí)酒糟水分含量、酸度、淀粉濃度和酒精度均存在顯著性差異(P<0.05)。其中，出窖時(shí)酒糟的酸度濃度、淀粉濃度和酒精度與李喆等[12]得出的結(jié)論一致，可能由于手工釀造窖池的窖齡更長(zhǎng)，窖池中的微生物更加適應(yīng)釀造過(guò)程，酒糟的理化特性也更加有利于釀酒微生物生長(zhǎng)代謝以及物質(zhì)交換。

2.2 酒糟揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

酒糟各操作環(huán)節(jié)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性與半定量分析結(jié)果如表2和圖2所示。

表2 酒糟各操作環(huán)節(jié)中揮發(fā)性成分變化 單位：mg/kg

結(jié)合圖2和表2，在各操作環(huán)節(jié)酒糟中共檢測(cè)出52種風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)22種，醇類物質(zhì)10種，酸類物質(zhì)11種，其他9種；各操作環(huán)節(jié)中，出甑酒糟入窖前，除打量水環(huán)節(jié)外，攤晾和下曲入窖環(huán)節(jié)酒糟風(fēng)味物質(zhì)種類及含量變化不明顯；隨著發(fā)酵結(jié)束，出窖酒糟中風(fēng)味物質(zhì)種類最多、含量最為豐富，而在拌料上甑和出甑操作環(huán)節(jié)時(shí)逐漸減少。

a-機(jī)械化釀造;b-手工釀造圖2 酒糟風(fēng)味物質(zhì)種類及含量圖Fig.2 Variety and content of flavor substances in distiller’s grain

酯類化合物是檢測(cè)到的種類和含量最多的一類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。在檢測(cè)到的酯類物質(zhì)中，乙酯類不僅種類多而且含量高，主要由醇類物質(zhì)與脂肪酸酯化產(chǎn)生，與酵母種類和酶活力等密切相關(guān)[13]。尹婉嬙等[14]研究表明，濃香型白酒中丁酸乙酯與己酸乙酯的比例<0.1，可以認(rèn)為其酒體協(xié)調(diào)。在本次檢測(cè)中，2種釀造方式的出窖酒糟中丁酸乙酯與己酸乙酯的比例<0.1。各操作環(huán)節(jié)酯類物質(zhì)中含量較高的是亞油酸乙酯、油酸乙酯，具有鮮花香氣，其中亞油酸乙酯還具有降低膽固醇和血脂的作用，這為白酒具有保健作用提供了理論依據(jù)[15]。

酸類化合物在窖池發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。酒糟中含量最高的為乙酸、棕櫚酸和己酸。在酒糟入窖后，窖泥中厭氧微生物不斷遷移至酒糟中，從而逐漸影響酒糟中有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)的代謝[16]。雷光電等[17]研究表明，酒糟越靠近窖泥，功能菌數(shù)量越多。DING等[18]對(duì)不同窖齡窖泥微生物研究表明，隨著窖齡增加，微生物不斷馴化，逐漸以梭菌占主導(dǎo)地位，并且產(chǎn)甲烷古菌與梭狀芽孢桿菌科微生物之間的協(xié)同關(guān)系和種間電子傳遞，可以促進(jìn)梭菌科微生物的生長(zhǎng)。研究表明，梭菌科微生物能將有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為酸類物質(zhì)，例如丁酸和己酸，從而促進(jìn)丁酸乙酯和己酸乙酯的生成[19]。

酒糟中醇類物質(zhì)主要由微生物對(duì)原料中的糖和氨基酸的降解產(chǎn)生，是酒體中微量香味物質(zhì)的基本組成部分[20]。醇類物質(zhì)中測(cè)得含量較高的為2,3-丁二醇、1,2-丙二醇和苯乙醇，具有一定的果香、奶香和玫瑰花香。在各操作環(huán)節(jié)酒糟風(fēng)味物質(zhì)中還檢測(cè)出3-羥基-2-丁酮、糠醛等物質(zhì)。研究表明，3-羥基-2-丁酮可由雙乙酰還原得到，同時(shí)也有學(xué)者推測(cè)3-羥基-2-丁酮可以作為酒體風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，與其他代謝物共同作用生成特征風(fēng)味物質(zhì)，如可能生成四甲基吡嗪[20-21]。糠醛在入窖前被檢測(cè)出，但在出窖時(shí)未檢測(cè)到，與周新虎等[22]研究較為一致。

總體來(lái)看，對(duì)2種釀造方式各操作環(huán)節(jié)中酒糟揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比較，其種類和含量變化趨勢(shì)基本一致，其中，出窖酒糟有39種共有風(fēng)味物質(zhì)，但手工釀造和機(jī)械釀造中出窖酒糟較入窖時(shí)風(fēng)味物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)率存在明顯區(qū)別，分別為153.17%和108.95%?？赡苡捎诮殉夭町?，窖池窖齡越老越利于微生物的積累與馴化，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的代謝產(chǎn)生[12]。同時(shí)，本次檢測(cè)到的出窖酒糟風(fēng)味物質(zhì)種類及含量與文獻(xiàn)[9,21,23]報(bào)道有一定差異，可能是受生產(chǎn)方式、檢測(cè)方法[23]和釀造地域等因素[24]影響。

2.3 OAV分析

為了確定香氣物質(zhì)對(duì)酒糟的影響，對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行OAV計(jì)算，結(jié)果如表3所示。將OAV>1的香氣物質(zhì)確定為酒糟的香氣特征貢獻(xiàn)組分，OAV值越大說(shuō)明對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)越大[9]。由表3可知，2種方式下出窖酒糟OAV>100的有己酸乙酯、辛酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯和3-羥基-2-丁酮；OAV>10的有己酸、丁酸、戊酸乙酯、丁酸乙酯和戊酸；OAV>1的有己酸丁酯、己酸己酯、正己醇、糠醇、乙酸和辛酸，這些物質(zhì)也是文獻(xiàn)[25-27]報(bào)道濃香型白酒典型風(fēng)味物質(zhì)。己酸乙酯是濃香型白酒的主體香氣物質(zhì)，本次出窖酒糟中OAV最大的也是己酸乙酯，且手工釀造出窖糟的己酸乙酯含量高于機(jī)械釀造。有研究表明，己酸乙酯含量與窖泥窖齡呈正相關(guān)，并且窖泥中己酸菌、丁酸菌等數(shù)量隨著窖齡的增加而增加[28-29]。結(jié)合表2與表3可知，2種釀造方式下出窖酒糟中濃香型白酒典型特征風(fēng)味物質(zhì)種類基本相同，但手工釀造酒糟的風(fēng)味物質(zhì)總含量高于機(jī)械釀造，可能是受窖齡影響所致[30]。

表3 各操作環(huán)節(jié)中酒糟OAV>1的香氣物質(zhì)Table 3 Aroma substances with OAV>1 in each operation

3 結(jié)論

本研究對(duì)2種釀造方式下各生產(chǎn)環(huán)節(jié)中酒糟的理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，機(jī)械化釀造方式下入窖酒糟各指標(biāo)符合生產(chǎn)工藝要求，由于手工釀造中上甑、打量水等均由人工操作，可能導(dǎo)致入窖水分含量、酸度濃度略高于規(guī)定參數(shù)范圍。2種釀造方式各生產(chǎn)環(huán)節(jié)中出窖酒糟物質(zhì)種類最多、含量達(dá)到最大值。通過(guò)GC-MS檢測(cè)與OAV分析，2種釀造方式下出窖酒糟中典型特征風(fēng)味物質(zhì)種類較為相似，但其出窖酒糟的風(fēng)味物質(zhì)含量有較大差別，手工釀造酒糟的風(fēng)味物質(zhì)總含量高于機(jī)械釀造，窖齡不同可能是導(dǎo)致這一差別的主要原因。后續(xù)還需對(duì)2種釀造方式下基酒出酒率以及風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行探究，進(jìn)一步解析基酒品質(zhì)與釀造方式的相關(guān)性。