桑躍，馮海紅，蒙璐，劉力，劉作文，葛紹陽(yáng)，金君華

1(北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京, 102206) 2(河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)研究中心，河北 三河, 065200)

2001年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)聯(lián)合專家委員會(huì)提出了益生菌的科學(xué)定義：益生菌系指活的微生物，當(dāng)攝取足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主健康有益[1]。在“健康中國(guó)”國(guó)家戰(zhàn)略的推動(dòng)下，益生菌的市場(chǎng)規(guī)?？焖贁U(kuò)大，到2018年已形成近千億元的龐大市場(chǎng)規(guī)模[2]。

益生菌粉(固體飲料類)是益生菌應(yīng)用的主要產(chǎn)品形式之一，特別是近幾年的益生菌市場(chǎng)，益生菌粉的種類和數(shù)量如雨后春筍般增長(zhǎng)，在市場(chǎng)火爆的同時(shí)，益生菌自主產(chǎn)權(quán)以及產(chǎn)品穩(wěn)定性也是人們關(guān)注的深層問題，這也是衡量一個(gè)企業(yè)能否長(zhǎng)久發(fā)展和參與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)的核心因素。

本文所研究的2株益生菌動(dòng)物雙歧桿菌A6和長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68均是分離自廣西巴馬長(zhǎng)壽老人腸道[3-4]。已有研究證明，動(dòng)物雙歧桿菌A6具有降低膽固醇、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和緩解小鼠便秘等多種益生功能[5]，還有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力[6]，有助于在腸道內(nèi)存活和定植；長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68是1株具有較低耐氧能力的益生菌[7]，有多篇研究報(bào)道長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68具有改善小鼠腸道消化功能[8-9]、增強(qiáng)小鼠免疫調(diào)節(jié)能力[10-11]和提高線蟲抗衰老功能等作用[12]。

目前，動(dòng)物雙歧桿菌A6和長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)完全成熟，能夠分別穩(wěn)定生產(chǎn)出活菌數(shù)在1.0×1012和1.0×1011CFU/g以上的菌粉，這2株益生菌已完全具備產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)，但為了進(jìn)一步提高2株雙歧桿菌菌粉的穩(wěn)定性，降低菌粉的儲(chǔ)運(yùn)成本，需要在包裝及貯藏方式方面開展系統(tǒng)研究，以期找到保持產(chǎn)品穩(wěn)定性的最優(yōu)方式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

動(dòng)物雙歧桿菌A6和長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68均由教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，其菌種專利保藏號(hào)分別為CGMCC 9273和 CGMCC 2265。

1.1.2 主要原輔料

益生菌凍干粉：動(dòng)物雙歧桿菌A6菌粉(活菌數(shù)1.2×1012CFU/g)、長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68菌粉(活菌數(shù)5.2×1010CFU/g)，三河福成生物科技有限公司。

輔料：低聚果糖，95型，山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司；乳清粉，D40型，Lactear S.A.；菊粉，NanoST P90型，豐寧平安高科實(shí)業(yè)有限公司；低聚半乳糖，GOS-700-P型，云浮市新金山生物科技有限公司。輔料在使用前進(jìn)行烘干處理。

包材：寬度58 mm，厚度8絲，鋁箔復(fù)合膜材質(zhì)，四川中金醫(yī)藥包裝有限公司。包材符合GB/T 28118—2011《食品包裝用塑料與鋁箔復(fù)合膜、袋》規(guī)定。

N2：標(biāo)準(zhǔn)氣，純度≥99.9%。

1.1.3 培養(yǎng)基

活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)股份有限公司。培養(yǎng)基按照說明配制，添加質(zhì)量濃度0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽，121 ℃滅菌15 min后置于48 ℃水浴鍋內(nèi)備用。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

LabSwift-aw便攜式水分活度儀，瑞士Novasina公司；CheckMate 3殘氧檢測(cè)儀，丹麥Dansensor公司；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DXDFZ60F全自動(dòng)粉劑包裝機(jī)，北京華清三豐科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

益生菌粉配方(g/L)：低聚果糖350，乳清粉300，菊粉200，低聚半乳糖100，菌粉50。

將A6菌粉和BBMN68菌粉按照配方與輔料進(jìn)行混合，以充氮和普通包裝工藝制備2種菌種的樣品，分別記為A6益生菌粉和BBMN68益生菌粉，樣品規(guī)格2 g/袋，每組樣品數(shù)量≥200袋。充氮樣品殘氧控制依據(jù)GB/T 26993—2011《奶粉定量充填包裝機(jī)》，殘氧量≤3%。包裝完成后，將樣品放置于-20、4、25和37 ℃的溫度下進(jìn)行儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)，分別在0、3、6、9和12個(gè)月取樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 水分含量測(cè)定

水分含量依據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》第一法(直接干燥法)進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)樣品在每個(gè)取樣點(diǎn)分別做3次平行測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.2.3 水分活度測(cè)定

將待檢樣品和水分活度儀放置于22～25 ℃、空氣相對(duì)濕度30%～40%的測(cè)定室平衡1～2 h。根據(jù)水分活度儀使用說明進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)樣品在每個(gè)取樣點(diǎn)分別做3次平行測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.2.4 活菌數(shù)測(cè)定

菌落計(jì)數(shù)依據(jù) GB 4789.34—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢測(cè) 雙岐桿菌檢驗(yàn)》中食品樣品雙歧桿菌計(jì)數(shù)方法,略作修改。稱取待檢樣1.0 g，置于裝有9.0 mL滅菌生理鹽水的離心管內(nèi)，旋渦振蕩1～2 min，制成10倍稀釋度樣品勻液，然后做10倍系列梯度稀釋，選取2～3個(gè)適宜稀釋梯度，分別吸取1.0 mL樣品勻液于無菌平板內(nèi)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平皿，及時(shí)將冷卻至46 ℃的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基傾注平皿，并單方向轉(zhuǎn)動(dòng)混合。待平板凝固后，倒置于厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)，(36±1)℃培養(yǎng)(48±2)h后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌粉儲(chǔ)藏過程中水分含量的變化

由表1和表2可知，2種益生菌粉隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，水分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))無明顯變化，數(shù)值均小于4%，這有助于益生菌粉的儲(chǔ)藏[13]。對(duì)比所有組別的水分含量，均無顯著性差異(P>0.05)，說明2種益生菌粉在儲(chǔ)藏過程中可保持其水分含量穩(wěn)定，且不受包裝方式和儲(chǔ)藏溫度的影響。

表1 A6益生菌粉儲(chǔ)藏過程中水分含量 單位：%

表2 BBMN68益生菌粉儲(chǔ)藏過程中水分含量 單位：%

2.2 益生菌粉儲(chǔ)藏過程中水分活度的變化

由圖1和圖2可知，當(dāng)儲(chǔ)藏溫度為-20和4 ℃時(shí)，2種益生菌粉水分活度無明顯變化；當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，水分活度在儲(chǔ)藏過程中開始緩慢上升；當(dāng)儲(chǔ)藏溫度為37 ℃時(shí)，水分活度變化顯著，A6和BBMN68益生菌粉2種包裝方式分別在第3和6個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異。因此，儲(chǔ)藏溫度對(duì)益生菌粉水分活度的影響較大，貯藏溫度越高，水分活度變化越大，而充氮包裝可降低水分活度的波動(dòng)，更好地維持產(chǎn)品穩(wěn)定，這與賈宏信[14]的研究結(jié)果相似。同時(shí)從結(jié)果可知，儲(chǔ)藏條件一致時(shí)，2種益生菌粉之間無顯著性差異。

圖1 A6益生菌粉儲(chǔ)藏過程中水分活度的變化Fig.1 Water activity change of A6 probiotics powder during storage 注：* 表示在相同儲(chǔ)藏溫度下，相同儲(chǔ)藏時(shí)間普通包裝與充氮 包裝結(jié)果呈顯著性差異(P>0.05)(下同)

圖2 BBMN68益生菌粉儲(chǔ)藏過程中水分活度的變化Fig.2 Water activity change of BBMN68 probiotics powder during storage

對(duì)于益生菌類粉劑產(chǎn)品而言，一般要求水分活度<0.25[15-16]，在低水分活度下可減少菌體的代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)保質(zhì)期，但水分活度不是越低越好，菌體仍需要一定量的水分來維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，水分活度<0.1時(shí)，細(xì)胞膜上的磷脂更容易被氧化，造成細(xì)胞損傷[17]。KURTMANN等[18]和VESTERLUND等[19]分別研究了嗜酸乳桿菌La-5和鼠李糖乳桿菌在不同水分活度的食品中的貯藏穩(wěn)定性，得到了相同的結(jié)果，當(dāng)水分活度為0.11時(shí)，菌體存活率最高。本文研究的2種益生菌粉水分活度均維持在0.1～0.13，可較好維持產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

2.3 益生菌粉貯藏過程中活菌數(shù)的變化

由圖3、圖4可知，在-20和4 ℃下，活菌數(shù)保持穩(wěn)定，存活率維持在85%以上；當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，活菌數(shù)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，儲(chǔ)藏期結(jié)束，A6和BBMN68益生菌粉充氮包裝活菌存活率分別為40.2%和32.7%，而普通包裝僅為28.0%和17.3%，差異顯著；當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，活菌數(shù)急劇降低，儲(chǔ)藏12個(gè)月，充氮和普通包裝的A6益生菌粉存活率分別為0.14%和0.033%，BBMN68益生菌粉為0.094%和0.013%。因此，溫度對(duì)益生菌粉的活菌穩(wěn)定性影響較大，即使在常溫下儲(chǔ)藏，活菌數(shù)仍會(huì)大幅度下降。

圖3 A6益生菌粉儲(chǔ)藏過程中的活菌數(shù)Fig.3 Survival of A6 in probiotics powder during storage

圖4 BBMN68益生菌粉儲(chǔ)藏過程中的活菌數(shù)Fig.4 Survival of BBMN68 in probiotics powder during storage

益生菌是活的生命體，對(duì)溫度極為敏感[20-23]。在較低溫度下，菌體處于休眠狀態(tài)，較為穩(wěn)定，高溫則導(dǎo)致菌體內(nèi)蛋白等物質(zhì)變性，功能喪失。而且不同菌株性狀差異較大，導(dǎo)致其對(duì)高溫的耐受能力不同[24-25]。由圖3和圖4結(jié)果可知，同樣在25和37 ℃儲(chǔ)藏下，A6益生菌粉的存活率普遍高于BBMN68益生菌粉，說明A6菌株具有更好的耐高溫性能。

此外，細(xì)胞膜氧化反應(yīng)也是影響菌體穩(wěn)定性的重要因素，細(xì)胞膜主要是由磷脂雙分子層構(gòu)成，而磷脂易與O2發(fā)生氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜不完整，高溫則會(huì)加速氧化速率，促使菌體死亡。ISHIBASHI等[26]證實(shí)了益生菌在有氧條件下存活率下降，TEIXEIRA等[20]研究了益生菌粉中添加抗氧化劑有利于益生菌活菌數(shù)的保持，因此，針對(duì)含有益生菌的產(chǎn)品，應(yīng)做到無氧包裝或增加除氧能力，以保證產(chǎn)品質(zhì)量。圖3和圖4結(jié)果表示，在37 ℃儲(chǔ)藏下，不同包裝的2種益生菌粉活菌數(shù)均在第3個(gè)月出現(xiàn)顯著性差異，儲(chǔ)藏期結(jié)束時(shí)，充氮包裝使A6和BBMN68益生菌粉存活率分別提升4.2和7.2倍，保護(hù)效果極為顯著。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，儲(chǔ)藏溫度是影響益生菌粉穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，冷凍和冷藏條件可較好維持產(chǎn)品品質(zhì)，當(dāng)儲(chǔ)藏溫度升高至常溫及以上時(shí)，產(chǎn)品穩(wěn)定性則隨溫度的升高顯著降低。通過改變包裝方式，證明了充氮包裝有利于益生菌粉儲(chǔ)藏，特別是對(duì)耐氧性較差的長(zhǎng)雙歧桿菌，可有效改善該類益生菌在產(chǎn)品中的應(yīng)用限制，促進(jìn)益生菌粉市場(chǎng)的發(fā)展。

從本文研究結(jié)果可知，益生菌粉最佳儲(chǔ)藏條件是冷凍或冷藏，然而這在實(shí)際操作中很難實(shí)現(xiàn)，特別是運(yùn)輸環(huán)節(jié)，不能保證全程冷鏈，且低溫運(yùn)輸也意味著需要更高的成本，不利于益生菌粉市場(chǎng)的發(fā)展。充氮包裝方式雖可改善益生菌粉穩(wěn)定性，但卻不能完全阻止益生菌死亡。所以如何提高常溫及更高溫度下益生菌粉的穩(wěn)定性依舊是關(guān)注的熱點(diǎn)，還需深入研究。