孫媛，孔祥珍，華欲飛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫,214122)

小麥面筋蛋白，又稱谷朊粉，蛋白質(zhì)含量高達(dá)75%～85%，是營養(yǎng)豐富的植物蛋白資源，其中的半胱氨酸(Cys)含量大約占2.0%～2.5%，高于常見的植物蛋白。利用蛋白酶酶解小麥面筋蛋白不僅可以增加小麥面筋蛋白的溶解性，還可以獲得具有抗氧化性[1-2]、抗高血壓性[3]和提高免疫力[4]等多種生物活性的小麥肽。其中，含半胱氨酸的肽具有重要的生理活性如廣譜抗菌性(含二硫鍵)[5]、抗氧化性(巰基)[6]、維持體內(nèi)巰基平衡[7]、鰲合重金屬[8]和促進(jìn)體內(nèi)鐵的吸收等。半胱氨酸含有游離的巰基，對于含半胱氨酸小麥肽的功能發(fā)揮著不可忽視的作用。

檢測巰基的方法有很多種，紫外與熒光檢測法具有檢測限低、靈敏度高、選擇性強(qiáng)和使用簡便等優(yōu)點(diǎn)，因此在硫醇檢測方面得到普遍應(yīng)用。GRAZYNA等[9]采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)，將化學(xué)衍生法和紫外檢測相結(jié)合，準(zhǔn)確測定了黃瓜葉片中半胱氨酸和谷胱甘肽的含量；RUAN等[10]利用單溴二胺(monobromobimane,mBBr)特異性標(biāo)記硫醇并結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定了大豆蛋白不同亞基/多肽的巰基含量，研究了巰基的氧化與巰基-二硫鍵(SH-SS)的交換；KANNAU等[11]用mBBr熒光標(biāo)記與SDS-PAGE方法對藻紅蛋白中的巰基進(jìn)行檢測與鑒定。巰基物質(zhì)常見的研究一般主要集中于定量檢測以及初步分離等，如崔秀云等[12]利用5種樹脂對含巰基物質(zhì)谷胱甘肽進(jìn)行靜態(tài)吸附分離；現(xiàn)報(bào)道的研究中對于巰基肽的分離純化大都采用大孔吸附樹脂與離子交換樹脂結(jié)合HPLC進(jìn)行分析，對于巰基肽主要是利用巰丙基Sepharose 6B樹脂進(jìn)行富集，丁秀臻[13]利用巰丙基樹脂對大豆11S制備的巰基肽進(jìn)行富集，巰基含量大大增加。巰基肽性質(zhì)研究以期為含半胱氨酸小麥肽的分離與富集提供新的思路與方法。

本文采用胃蛋白酶對小麥面筋蛋白進(jìn)行酶解制備含半胱氨酸小麥肽，并探究還原處理對含半胱氨酸小麥肽的影響；其次利用巰丙基樹脂共價(jià)色譜靜態(tài)吸附法對含半胱氨酸小麥肽進(jìn)行分離富集，探究其性質(zhì)；最后采用mBBr對制備的含半胱氨酸小麥肽進(jìn)行熒光標(biāo)記與表征。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

小麥面筋蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)75.0%)，安徽安特有限公司；

尿素、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、檸檬酸、檸檬酸鈉、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, EDTA-2Na)、鹽酸胍(GuHCl)、二氯甲烷、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA),均為分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)、胃蛋白酶；還原性谷胱甘肽、4,4-二硫二吡啶(4, 4-dithiopyridine，4-DPS)、單溴二胺(monobromobimane，mBBr)，Sigma-Aldrich公司；硫代丙基Sepharose 6B凝膠，GE公司；醋酸纖維素膜、透析袋，北京中生瑞泰科技有限公司。

SC-15型智能節(jié)能恒溫循環(huán)水浴鍋，寧波新芝生物科技股份有限公司；超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；LGJ-18型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)儀器廠；UV2450型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；90型磁力攪拌器、旋渦震蕩儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；pH計(jì)，Mettler-Toledo儀器有限公司；CR21N型高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；氮吹儀，無錫久平儀器有限公司；安捷倫高效液相色譜儀；TSK-gel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)型色譜柱；YMC-Pack Pro C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 小麥面筋蛋白含半胱氨酸小麥肽的制備

1.2.1 胃蛋白酶酶解

配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的小麥面筋蛋白溶液，并用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至2.0，循環(huán)水浴鍋提前預(yù)熱至37 ℃，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶進(jìn)行酶解，時間為6 h,酶解結(jié)束后沸水浴滅酶10 min終止反應(yīng)。在8 000 r/min條件下離心30 min，上清液為酶解物。

1.2.2 DDT還原后胃蛋白酶酶解

參考陳海橋等[14]的方法制備含半胱氨酸小麥肽。將小麥面筋蛋白以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%蛋白含量分散于含50 mmol/L二硫蘇糖醇的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，0.1 mol/L)中，室溫下不斷攪拌。采用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.0,采用透析袋(截留相對分子質(zhì)量為3 000 Da)進(jìn)行透析。透析結(jié)束后，胃蛋白酶進(jìn)行酶解制備含半胱氨酸小麥肽，酶解條件同1.2.1小節(jié)中的方法。

1.2.3 胃蛋白酶酶解后DTT還原

為了探究還原與酶解操作先后順序?qū)τ诤腚装彼嵝←滊牡挠绊懀M(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。胃蛋白酶酶解同1.2.1小節(jié)中的方法，酶解制備的樣品中加入50 mmol/L DTT，進(jìn)行二硫鍵的還原，還原時間為2 h，還原結(jié)束進(jìn)行透析處理，裝入500 Da透析袋中透析48 h。透析結(jié)束后8 000 r/min離心30 min，所得上清液進(jìn)行干燥，即得酶解還原樣。

1.3 巰基含量的測定

采用4-DPS[13]法測定制備的含半胱氨酸小麥肽的巰基含量。配制一定濃度的酶解液樣品，取0.45 mL樣品溶液，加入188 μL 4 mmol/L 4-DPS溶液，再加入4.05 mL pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%SDS)，混合均勻，室溫反應(yīng)30 min，在波長為324 nm下測定吸光值。

試劑空白：用去離子水代替4-DPS作為試劑空白;蛋白空白：用去離子水代替樣品作為蛋白空白。

巰基含量的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：x,巰基含量,μmol/g蛋白；A324,樣品在324 nm處的吸光值；A324試劑,試劑空白在324 nm處的吸光值；A324蛋白,蛋白空白在324 nm處的吸光值；ε,吸光系數(shù)，該實(shí)驗(yàn)中取值為21 400[(mol/L)-1·cm-1]；b,光程，本處取1 cm；c,蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL。

通過凱氏定氮法測定酶解物中蛋白質(zhì)濃度，對于體系中二硫鍵的還原，采用了2種方式，(1)利用還原劑硼氫化鈉(NaBH4)還原，NaBH4具有強(qiáng)還原性且分子中沒有巰基，因此可以直接還原二硫鍵后進(jìn)行巰基含量的測定[9]。(2)采用還原劑二硫蘇糖醇，但二硫蘇糖醇本身帶有巰基，在二硫鍵還原為巰基之后要進(jìn)行脫除處理。

1.4 mBBr標(biāo)記

向0.25 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(含8 mol/L GuHCl pH 7.5)緩沖液中加入25 μL 10 mmol/L mBBr(溶解在純乙腈中)，混勻后加入225 μL樣品，此時反應(yīng)體系的體積為0.5 mL，25 ℃黑暗反應(yīng)90 min。反應(yīng)結(jié)束后加入3 mL二氯甲烷洗滌3次，每次旋渦振蕩30 s，去除過量的mBBr。離心去除二氯甲烷層，上層樣品用0.22 μm的醋酸纖維素膜過濾，收集下層濾液，分析前4 ℃避光保存。

1.5 共價(jià)色譜靜態(tài)吸附法富集含半胱氨酸小麥肽

用100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，含5 g/L SDS)配制蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的樣品,加入微量還原劑DTT，防止巰基被氧化，將樣品和制備好的硫代丙基Sepharose 6B凝膠一起置于錐形瓶中，氮吹排除整個體系中的空氣，并在氮?dú)饬鞯沫h(huán)境中以m(巰基)∶m(配基)=4∶5將樣品與樹脂在25 ℃進(jìn)行2 h鍵合(置于搖床)反應(yīng)。

鍵合結(jié)束，用緩沖液將未鍵合上的含半胱氨酸小麥肽洗去，用100 mmol/L Tris-HCl(含25 mmol/L DTT,pH 7.5)對鍵合上的含半胱氨酸小麥肽進(jìn)行洗脫，每次0.5 h，室溫置于搖床進(jìn)行2次洗脫，取解析液。采用透析的方式去除洗脫液中DTT，透析48 h。透析后干燥得到富集的樣品。

圖1 巰基-二硫鍵交換示意圖Fig.1 Schematic diagram of the exchange reaction of SS and SH

1.6 相對分子質(zhì)量的測定

采用HPLC測定含半胱氨酸小麥肽的相對分子質(zhì)量。選擇安捷倫液相色譜系統(tǒng)，TSK-gel G2000SWXL(300 mm×7.8 mm，5 μm)型色譜柱，配置有紫外檢測器和熒光檢測器，流動相為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1，流速：0.5 mL/min，紫外檢測波長為214 nm，熒光激發(fā)波長390 nm，檢測波長476 nm，柱溫30 ℃，時間40 min，通過與標(biāo)準(zhǔn)樣品出峰時間對比，確定樣品的相對分子質(zhì)量分布。

對于還原的樣品，在透析除去還原劑并保持低pH的情況下，體系的巰基比較穩(wěn)定，并以游離狀態(tài)存在，用mBBr標(biāo)記，其出峰的位置即代表含半胱氨酸小麥肽，進(jìn)而對相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定。

1.7 親疏水性測定

采用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，檢測器為紫外檢測器和熒光檢測器，流動相A相：超純水，含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA；B相：乙腈，含0.085%(體積分?jǐn)?shù))TFA，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為214 nm，熒光激發(fā)波長390 nm，檢測波長476 nm，柱溫25 ℃，時間80 min，采用梯度洗脫：0～5 min，5%B→10～60 min，線性變換B的濃度到60%→60～65 min，線性變換B的濃度到100%→65～70 min，線性變換B的濃度到5%→70～75 min，保持B的濃度為5%。根據(jù)液相譜圖對含半胱氨酸小麥肽的親疏水性進(jìn)行分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin Pro 8.5和IBM SPSS Statistics V 22.0進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥面筋蛋白含半胱氨酸小麥肽的巰基含量

小麥面筋蛋白中總巰基含量為(200±20) μmol/g蛋白(表1)。胃蛋白酶在酶解小麥面筋蛋白的過程中，選擇性酶切，因此有一部分較大分子的含半胱氨酸小麥肽會隨離心力的作用而進(jìn)入沉淀中，造成含半胱氨酸小麥肽的損失，所以胃蛋白酶酶解樣品(pepsin hydrolysis,Ph)中巰基的含量比其他幾種處理方式所得的巰基含量低。經(jīng)過還原，二硫鍵被打斷，分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變得松散，胃蛋白酶能更好地對大分子肽段進(jìn)行酶解，因此先還原后酶解樣品(reduction and pepsin hydrolyzes,RPh)中巰基含量高。對于先酶解后還原樣品(pepsin hydrolyzes and reduction,PhR),酶解之后一部分大分子變?yōu)樾》肿?，再?jīng)過還原劑的作用，使得原本因二硫鍵連接在一起的大分子肽段轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿与亩?，在離心操作中原本進(jìn)入沉淀的大分子肽段進(jìn)入上清液，提高了上清液中含半胱氨酸小麥肽的含量與得率，因此巰基含量提高。

表1 小麥面筋蛋白含半胱氨酸小麥肽的巰基含量 單位：μmol/g

由表1可知，除了Ph樣品外各組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異(P>0.05)，與單純酶解相比，還原步驟能很好地增強(qiáng)酶解的效果使得酶解過程中進(jìn)入沉淀的含半胱氨酸小麥肽轉(zhuǎn)入上清液，提高上清液含半胱氨酸小麥肽的含量與得率。對于還原劑DTT而言，先還原或后還原所得的含半胱氨酸小麥肽巰基的含量沒有顯著差異(P>0.05)，2種處理方式都能夠很好地將體系中二硫鍵還原為巰基。

2.2 小麥面筋蛋白含半胱氨酸小麥肽的相對分子質(zhì)量分布

Ph、RPh和PhR的相對分子質(zhì)量分布如圖2所示。幾種處理方式得到含半胱氨酸小麥肽的相對分子質(zhì)量從300 ～10 kDa均有分布，但相比于小麥面筋蛋白相對分子質(zhì)量(醇溶蛋白30 k～60 kDa，麥谷蛋白80 000至數(shù)百萬Da[20])小了很多。對于Ph樣品，相對分子質(zhì)量分布>5 000 Da的組分大約占57.36%；而RPh中，相對分子質(zhì)量分布>5 000 Da的組分占比降低為29.80%，相對分子質(zhì)量分布 <300 Da組分占比由原來Ph 中8.85%提高到16.70%，這可能是因?yàn)镽Ph樣品先經(jīng)過還原劑的處理之后，小麥面筋蛋白分子中的二硫鍵被打斷，結(jié)構(gòu)變得比較松散，更有利于酶切位點(diǎn)的暴露，使得胃蛋白酶酶解更加徹底；相比前2種樣品PhR樣品相對分子質(zhì)量>5 000 Da組分的占比高達(dá)48.34%，相對分子質(zhì)量 <1 000 Da的組分占比為4.27%，小于還原酶解樣16.70%，這與透析該步驟有關(guān)，酶解后的相對分子質(zhì)量比還原后的相對分子質(zhì)量更小，選擇500 Da的透析袋透析，在透析的過程中相對分子質(zhì)量較小的肽段會損失，所以小分子占比降低。而相比較RPh樣品在酶解之前便透析除去了還原劑與較小分子的肽段，再經(jīng)過酶解之后所產(chǎn)生的小分子肽段主要是胃蛋白酶酶解大分子蛋白所得。

圖2 酶解肽段相對分子質(zhì)量分布Fig.2 Molecular weight distribution of enzymatic peptides

對各個時間段的相對分子質(zhì)量曲線進(jìn)行積分，各個相對分子質(zhì)量段的占比如表2所示。其中I(0～14.38 min)；II(14.38～17.84 min)；III(17.84～20.41 min)。

表2 各個組分相對分子質(zhì)量占比 單位：%

從圖1中也可以看出，經(jīng)過透析之后還原劑DTT的峰消失，說明透析能很好地除去DTT。

2.3 共價(jià)色譜靜態(tài)吸附法富集含半胱氨酸小麥肽

由2.1小節(jié)可知小麥面筋蛋白巰基含量為(200±20) μmol/g蛋白，RPh樣品中的巰基含量為(195.10±12.79) μmol/g蛋白，采用4-DPS法測定了巰丙基樹脂富集后的樣品的巰基含量為(994.95±9.31) μmol/g蛋白。說明經(jīng)過巰丙基樹脂的富集，含半胱氨酸小麥肽得到富集，巰基含量上升約為原來的5倍。

對圖3-a各個組分的面積進(jìn)行分析，與未富集的樣品相比，經(jīng)過富集的樣品I組分占比明顯增大，由29.80%增至48.46%，相對分子質(zhì)量>5 000 Da的組分相對于其他組分得到了更好地富集，說明巰丙基樹脂富集的主要是較大相對分子質(zhì)量的含半胱氨酸小麥肽，這可能是因?yàn)榇蠓肿与亩蜗啾扔谛》肿与亩嗡鶐У膸€基部分更易與樹脂上的特異性基團(tuán)作用；II組分在富集之前與富集之后占比分別為49.34%與41.62%，占比有所下降；III組分由于相對分子質(zhì)量太小隨著洗脫液洗出而損失，所以在3個組分中富集程度最小，僅占7.93%。

a-相對分子質(zhì)量分布;b-親疏水性分析圖3 巰丙基樹脂富集半胱氨酸肽段的HPLC表征Fig.3 Characterization of cysteine peptides enriched with mercaptopropyl resin by HPLC

在20～60 min內(nèi)隨著時間的增加，有機(jī)相的比例在不斷增加，出峰時間越晚，組分的疏水性越大。由圖3-b可知，經(jīng)過富集的樣品疏水性增加，親水性降低。這與富集樣品中相對分子質(zhì)量大的組分占比較大有一定的關(guān)系，相對分子質(zhì)量越大，出峰時間越晚，疏水性越強(qiáng)。

2.4 小麥面筋蛋白含半胱氨酸小麥肽的表征

2.4.1 mBBr標(biāo)記含半胱氨酸小麥肽

利用反相高效液相色譜探究酶解生成的含半胱氨酸小麥肽是否具有獨(dú)特的親疏水性。對未富集與富集的樣品進(jìn)行mBBr熒光標(biāo)記(圖4)，對比沒有用mBBr標(biāo)記的樣品，發(fā)現(xiàn)未富集與富集的樣品在不經(jīng)過mBBr熒光標(biāo)記時，在熒光的檢測波長下均沒有熒光特性的特征峰出現(xiàn)，樣品本身不產(chǎn)生熒光性，熒光標(biāo)記試劑對巰基肽具有特異性。

從圖4可以看出，標(biāo)記之后的含半胱氨酸小麥肽在30～50 min之間均有熒光圖譜，親疏水性并不單一。對比未富集樣品與富集樣品的熒光譜圖，熒光的面積明顯增大，說明含半胱氨酸小麥肽達(dá)到了富集。將圖譜分為3個組分I、II、III，組分I的親水性最好，組分III疏水性最強(qiáng)。對比富集前后3個組分的占比發(fā)現(xiàn)，富集樣品中組分I的占比為15.63%，大于未富集3.28%，組分III占比則由61.21%下降為33.52%，說明該樹脂對含半胱氨酸小麥肽中親水性的組分富集程度要大于疏水性組分。

2.4.2 含半胱氨酸小麥肽的表征

含半胱氨酸小麥肽用mBBr標(biāo)記后的熒光圖譜與含半胱氨酸小麥肽本身的紫外圖譜如圖5所示。

圖4 mBBr標(biāo)記含半胱氨酸肽的HPLC表征Fig.4 Characterization of mBBr labeled cysteine-containing peptides by HPLC

從圖5-a可以看出，含半胱氨酸小麥肽的相對分子量在300～10 000 Da均有分布，對比圖5-a中紫外圖譜與熒光圖譜，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量>5 000 Da的組分在紫外圖譜中占48.02%，但在熒光譜圖中僅占8.97%，而<1 000 Da的組分在熒光譜圖中面積的占比為51.92%，遠(yuǎn)大于在紫外譜圖中的面積占比(10.36%)，這說明小分子組分對于含半胱氨酸小麥肽標(biāo)記后的熒光值的貢獻(xiàn)高，即相對分子質(zhì)量<1 000 Da的組分中巰基的含量更高。

用反相高效液相色譜來分析肽段的親疏水性，出峰時間主要在35～50 min(圖5-b)，通過標(biāo)記后的熒光圖譜可以看出，標(biāo)記組分的親疏水性與富集組分的親疏水性基本一致。結(jié)合相對分子質(zhì)量分析，含半胱氨酸小麥肽含量高的肽段主要是相對分子質(zhì)量<5 000 Da中疏水的組分，可以利用該性質(zhì)指導(dǎo)含半胱氨酸小麥肽的進(jìn)一步分離富集。

a-相對分子質(zhì)量分布; b-親疏水性分析圖5 半胱氨酸肽的HPLC表征Fig.5 HPLC characterization of cysteine-containing peptides

3 結(jié)論

通過不同的酶解方式制備了含半胱氨酸小麥肽，研究了還原處理對于含半胱氨酸小麥肽制備的影響，采用巰丙基樹脂對含半胱氨酸小麥肽進(jìn)行共價(jià)色譜靜態(tài)吸附并結(jié)合mBBr進(jìn)行標(biāo)記與表征。結(jié)果表明，還原處理能很好地將二硫鍵轉(zhuǎn)化為巰基，還原的先后順序?qū)λ苽涞暮腚装彼嵝←滊闹袔€基含量影響不大，巰基含量均在(200±20) μmol/g蛋白范圍內(nèi)。經(jīng)過樹脂富集之后巰基含量由原來的(200±20) μmol/g蛋白提高到(994.95±9.31) μmol/g蛋白，富集之后相對分子質(zhì)量>5 000 Da組分的占比增大，疏水性增大。mBBr能很好地標(biāo)記含半胱氨酸小麥肽，經(jīng)標(biāo)記發(fā)現(xiàn)經(jīng)過富集的肽段中<5 000 Da的組分占比低，但對于熒光的貢獻(xiàn)值大，且疏水性組分的貢獻(xiàn)要大于親水性組分。這些發(fā)現(xiàn)為含半胱氨酸小麥肽的制備與分離提供了依據(jù)。但是，在關(guān)于含半胱氨酸小麥肽的研究中，除了改進(jìn)酶解方法之外，對相對分子質(zhì)量<5 000 Da疏水性的組分需要進(jìn)一步的分離與分析。