謝夢夢，胡會濤，陸信曜，宗紅，諸葛斌*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無錫，214122)

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)作為一種重要的高附加值化工原料，主要用于合成新型聚酯纖維聚對苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethyleneterephthalate, PTT)[1]。作為1,3-PDO的天然生產(chǎn)菌株，克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)因其高效的甘油代謝途徑而備受關(guān)注[2-3]。

K.pneumoniae通過甘油還原途徑合成1,3-PDO，通過氧化途徑獲得細胞生長所需的能量和還原力，同時產(chǎn)生乙酸、乳酸、2,3-丁二醇和乙醇等副產(chǎn)物[4-7]。其中乙酸和乳酸的合成不僅造成碳源浪費，還會使培養(yǎng)基酸化，抑制菌體生長[8]。乙酸的合成伴隨著ATP產(chǎn)生，直接阻斷乙酸的合成途徑，往往會抑制細胞生長，不利于1,3-PDO的合成[9]。乙酸溢流通常是由底物攝取和下游途徑合成分解代謝之間的不平衡引起的[10]。許多研究通過增加乙酰輔酶A節(jié)點的碳流和提高TCA循環(huán)的活性來提高1,3-PDO的產(chǎn)量，并取得一定成效[11-13]，但鮮有改變乙醛酸循環(huán)代謝途徑對1,3-PDO合成影響的研究報道。

作為TCA循環(huán)的代謝支路，乙醛酸循環(huán)的適當加強，可能會增加乙酰輔酶A節(jié)點流向草酰乙酸等下游路徑的碳流，進而緩解甘油氧化途徑中碳源的溢出。敲除乙醛酸循環(huán)抑制因子iclR基因會強化乙醛酸循環(huán)，同時降低乙酸的積累，緩解乙酸溢流問題[13-14]。研究表明， TCA循環(huán)活性增強，琥珀酸脫氫酶基因sdhC轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，進而增加胞內(nèi)還原力的供應(yīng)[15]。在厭氧條件下，克雷伯氏菌中幾個TCA循環(huán)相關(guān)基因異檸檬酸脫氫酶基因icd、富馬酸酶基因fumA及蘋果酸脫氫酶基因mdh的轉(zhuǎn)錄水平較低[16]。同時，mdh基因作為乙醛酸循環(huán)途徑相關(guān)基因，過表達該基因可強化乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)?；诖耍疚囊匀樗岷土姿徂D(zhuǎn)移酶系統(tǒng)共缺失的改造菌株K.pLr為出發(fā)菌株，敲除iclR基因，并過表達sdhC和mdh基因，擬將乙酰輔酶A節(jié)點的碳流引入下游以探究乙醛酸和TCA循環(huán)的改造對K.pneumoniae合成1,3-PDO的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究使用的菌株和質(zhì)粒見表1。壯觀霉素、硫酸卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)、阿拉伯糖、氯霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；TaqDNA 聚合酶，大連寶生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；HPLC高效液相色譜儀，美國戴安公司；液相色譜柱: Aminex HPX-87H column(300 mm×7. 8 mm; 9 μm), BioRad公司; 電轉(zhuǎn)儀、PCR儀，Eppendorf 公司;1,3-PDO標準品，Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；發(fā)酵罐(BIOTECH 5 L)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；引物由上海亦欣生物科技有限公司合成。

表1 本文使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 引物

本研究所使用引物見表2。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，NaCl 10，酵母粉 5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 40，酵母粉 6，葡萄糖 6，KH2PO47.5，MgSO42，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，VB120.001 5，微量元素溶液 0.1 mL，KOH調(diào)pH至7.5。微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl20.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035。

表2 本研究使用引物Table 2 Primers used in this study

種子培養(yǎng)：LB培養(yǎng)基用于種子培養(yǎng)，1%接種量(體積分數(shù))，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h。發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL三角瓶中裝液量為50 mL，4%接種量(體積分數(shù))，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)48 h。分批補料發(fā)酵：5 L發(fā)酵罐裝液量3 L，4%接種量(體積分數(shù))，初始甘油質(zhì)量濃度為20 g/L，pH電極在線監(jiān)控，用10 mol/L的KOH維持pH為7，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)72 h。發(fā)酵過程中甘油質(zhì)量濃度維持在5～30 g/L。

1.4 菌株構(gòu)建

按照文獻[17]的報道進行基因敲除。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，擴增目的基因上下游各500 bp的整合片段作為供體，構(gòu)建帶有目的基因sgRNA的pTargetF-pMB質(zhì)粒。將帶有卡那霉素抗性的質(zhì)粒pCas9轉(zhuǎn)入K.pneumoniae，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素)，加入阿拉伯糖誘導(dǎo)，制備K.pneumoniae電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞。將供體和pTargetF-pMB質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至K.pneumoniae感受態(tài)細胞，涂布于含有卡那霉素和壯觀霉素的LB培養(yǎng)基上，PCR驗證獲得敲除菌株。敲除成功菌株在30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)至OD600=0.4時，加入IPTG(終濃度0.5 mol/L)過夜誘導(dǎo)12 h消除pTargetF-pMB質(zhì)粒；在42 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)消除pCas9質(zhì)粒。

1.5 基因表達載體構(gòu)建

以E.coliW3110基因組為模板，PCR擴增得到sdhC和mdh基因，經(jīng)酶切連接至pRSFDuet-Ptac質(zhì)粒中，得pRSFDuet-Ptac-sdhC和pRSFDuet-Ptac-mdh質(zhì)粒；再以pRSFDuet-Ptac-mdh質(zhì)粒為模板，擴增得到Ptac-mdh片段，經(jīng)同源重組連接得到pRSFDuet-Ptac-sdhC-Ptac-mdh質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證和基因測序正確后轉(zhuǎn)入K.pLric，得到菌株K.pLric-sdhC、K.pLric-mdh和K.pLric-sdhC-mdh。

1.6 測定方法

生物量用600 nm波長處吸光值(OD600)表示。測定細胞干質(zhì)量，計算得到：1 OD=0.36 g/L。1,3-PDO、乙酸和琥珀酸等代謝產(chǎn)物用HPLC法檢測，色譜柱為Aminex HPX-87H，柱溫60 ℃，使用示差檢測器；5 mmol/L H2SO4為流動相，流速為0.6 mL/min，進樣量為10 μL[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 iclR基因敲除對細胞生長和代謝的影響

乙醛酸循環(huán)抑制因子iclR基因通過抑制aceBAK操縱子的表達抑制乙醛酸循環(huán)[19-20]。敲除iclR可以激活乙醛酸循環(huán)，將乙酰輔酶A節(jié)點處碳流引入下游TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)，進而合成細胞所需的能量和中間代謝物[13]。與出發(fā)菌株K.pLr相比，K.pLric的生物量提高了15%(圖1-a)，1,3-PDO產(chǎn)量由16.5 g/L提高到17.8 g/L(圖1-b)，表明敲除iclR有利于菌體生長。乙醛酸循環(huán)是乙酸同化的主要途徑，抑制因子iclR的敲除可以提高從乙酸到乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。發(fā)酵8 h時，K.pLric的乙酸積累量從2 g/L降低到1.1 g/L(圖2-a)，1,3-PDO產(chǎn)量由4.4 g/L提高到8.8 g/L(圖1-b)，表明前期乙酸積累量的降低減少了對細胞的毒害作用，1,3-PDO大量合成。此外，由于敲除iclR基因可以明顯提高從磷酸烯醇式丙酮酸到乙酰輔酶A的碳流[21]，從而使K.pLric的琥珀酸產(chǎn)量提高了41%，2,3-丁二醇和乙醇的產(chǎn)量分別降低了21%和20%，且乙醇延遲8 h開始積累(圖2)。副產(chǎn)物產(chǎn)量的降低減少了對碳源和還原力的競爭，使得部分碳流偏向甘油還原途徑，更有利于1,3-PDO的合成。

a-生物量;b-甘油消耗量及1,3-丙二醇產(chǎn)量圖1 搖瓶發(fā)酵過程中重組菌的生物量、甘油消耗量 及1,3-丙二醇產(chǎn)量Fig.1 Biomass,glycerol consumption and concertration of 1,3-PDO in recombinants in shake flasks

2.2 過表達sdhC或mdh基因?qū)毎L和代謝的影響

sdhC基因編碼琥珀酸脫氫酶，催化琥珀酸到富馬酸的脫氫反應(yīng)。過表達sdhC基因可以提高TCA循環(huán)活性，進一步促進乙酰輔酶A節(jié)點的碳流流向下游TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)。如圖3-a所示，K.pLric-sdhC在18 kDa處有明顯的重組蛋白條帶，表明sdhC表達成功。與K.pLric相比，重組菌K.pLric-sdhC的生物量略有降低(圖1-a)，單位菌體甘油消耗量增加了6%，1,3-PDO的產(chǎn)量和摩爾轉(zhuǎn)化率分別從17.8 g/L和0.55 mol/mol提高到了19 g/L和0.59 mol/mol，表明過表達sdhC基因提高了菌體的甘油利用能力，強化了1,3-PDO合成。同時，過表達sdhC基因會降低K.pLric-sdhC中琥珀酸的積累，促使丙酮酸節(jié)點的碳流流向乙酰輔酶A。與K.pLric相比，K.pLric-sdhC中琥珀酸和2,3-丁二醇的產(chǎn)量分別減少了29%和47%，乙酸產(chǎn)量提高了21%(圖2)。發(fā)酵16 h，琥珀酸積累量為0.5 g/L，比K.pLric降低了38%，2,3-丁二醇在前期積累，后期作為還原力明顯降低[22]。

a-乙酸產(chǎn)量;b-琥珀酸產(chǎn)量;c-2,3-丁二醇產(chǎn)量；d-乙醇產(chǎn)量圖2 搖瓶發(fā)酵過程中重組菌的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量Fig.2 Concertration of metabolites in recombinants in shake flasks

mdh基因編碼蘋果酸脫氫酶，催化蘋果酸和草酰乙酸之間的反應(yīng)，該酶可以緩解丙酮酸節(jié)點處的碳流積累，增加乙酰輔酶A節(jié)點處的碳流流向TCA循環(huán)。如圖3-a，K.pLric-mdh在35 kDa處有明顯的重組蛋白條帶，表明mdh表達成功。與K.pLric相比，重組菌K.pLric-mdh的琥珀酸、2,3-丁二醇和乙醇的產(chǎn)量分別降低了27%、52%和22%(圖2)，但乙酸積累量增加了16%(圖2-a)。乙酸的合成常常伴隨著能量的產(chǎn)生[11]，K.pLric-mdh在發(fā)酵過程中菌體生長始終優(yōu)于K.pLric(圖1-a)，因此,乙酸積累也為細胞生長提供了能量。最終，K.pLric-mdh的1,3-PDO產(chǎn)量達19.3 g/L(圖1-b)，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.59 mol/mol。

2.3 共表達sdhC和mdh基因?qū)毎L和代謝的影響

結(jié)合2種策略，在K.pLric中共表達sdhC和mdh基因，以期進一步增加乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)的碳流。如圖3-a所示，K.pLric-sdhC-mdh在18 kDa和35 kDa處有明顯的重組蛋白條帶，表明sdhC和mdh共表達成功。如圖1-a所示，K.pLric-sdhC-mdh的生物量與K.pLric-sdhC相比無明顯變化，比K.pLric和K.pLric-mdh的生物量略有降低，但K.pLric-sdhC-mdh的單位菌體甘油消耗量均高于單獨過表達sdhC或mdh基因的菌株及K.pLric，分別提高了5%、11%和11%(圖1-b)，表明共表達sdhC和mdh基因可以進一步強化乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)，提高菌體的甘油利用能力。

M-蛋白 Marker；1-K. p Lric-mdh胞內(nèi)可溶蛋白； 2-K. p Lric胞內(nèi)可溶蛋白；3-K. p Lric-sdhC胞內(nèi)可溶蛋白圖3 重組菌的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinants

研究發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)會增加TCA循環(huán)的碳流，弱化乙酸合成，提高胞內(nèi)還原力[9]。與單獨過表達sdhC或mdh基因相比，共表達sdhC和mdh基因進一步提高了TCA循環(huán)活性，為細胞生長提供了更多的能量，使得K.pLric-sdhC-mdh的乙酸產(chǎn)量分別降低了13%和6%(圖2-a)。此外，與K.pLric相比，K.pLric-sdhC-mdh中琥珀酸、2,3-丁二醇和乙醇的積累量分別降低了34%、65%和28%，發(fā)酵24 h乙酸積累量為1.2 g/L，降低了40%(圖2-a)，表明共表達sdhC和mdh基因進一步緩解了丙酮酸節(jié)點的碳流積累，促使乙酰輔酶A節(jié)點處的碳流流向TCA循環(huán)，弱化了2,3-丁二醇的合成和乙酰輔酶A節(jié)點處的碳流溢出，使更多碳流偏向1,3-PDO合成。最終，K.pLric-sdhC-mdh的1,3-PDO產(chǎn)量達19.8 g/L(圖1-b)，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.6 mol/mol，分別比K.pLric提高了20%和15%。

2.4 5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵

根據(jù)K.pLric-sdhC-mdh改造菌株在搖瓶中取得的顯著效果，進一步探究K.pLric-sdhC-mdh在5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵中細胞生長和1,3-PDO合成的情況。如圖4-a所示，出發(fā)菌株K.pLr中乙酸積累量高達12.6 g/L，而K.pLric-sdhC-mdh中乙酸積累量降低了27%(圖4-b)。此外，K.pLric-sdhC-mdh的生物量提高了14%，2,3-丁二醇積累量降低了17%，表明乙醛酸循環(huán)的激活促使溢出碳流經(jīng)乙酰輔酶A流向TCA循環(huán)，同時TCA循環(huán)的強化為細胞生長和1,3-PDO的合成提供了ATP和還原力。

a-K. p Lr;b-K. p Lric-sdhC-mdh圖4 K. p Lr 和K. p Lric-sdhC-mdh在5 L發(fā)酵罐中 分批補料發(fā)酵情況Fig.4 5 L Fed-batch fermentations of K. p Lr and K. p Lric-sdhC-mdh

有研究通過在K.pneumoniae中敲除乙酰輔酶A再生抑制因子pdhR，但是僅將1,3-PDO產(chǎn)量提高到60.4 g/L[25]。敲除TCA循環(huán)抑制因子arcA，提高TCA循環(huán)活性，1,3-PDO產(chǎn)量為78.1 g/L，提高了28%[15]。在K.pneumoniae中敲除poxB、pta-ackA基因以降低乙酸合成提高1,3-PDO產(chǎn)量，結(jié)果重組菌中1,3-PDO產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別為76.8 g/L和0.66 mol/mol[23]。此外，有研究考察了丙酮酸乙酰輔酶A開關(guān)對1,3-PDO合成的影響，結(jié)果表明,提高1,3-PDO產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率2者不可兼得[26]。目前尚未有乙醛酸改造對K.pneumoniae合成1,3-PDO影響的報道，乙醛酸作為TCA循環(huán)的代謝支路，適當加強可以有效緩解乙酸溢流，提高1,3-PDO合成。最終，K.pLric-sdhC-mdh在5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵中1,3-PDO的產(chǎn)量達77.2 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.69 mol/mol，分別高于出發(fā)菌株42%和11%。

3 結(jié)論

本研究對K.pLric中乙醛酸循環(huán)抑制因子iclR進行了敲除，并考察了過表達TCA循環(huán)相關(guān)基因琥珀酸脫氫酶基因sdhC和蘋果酸脫氫酶基因mdh對K.pneumoniae細胞生長和1,3-PDO合成的影響。結(jié)果表明，iclR基因的敲除可以激活乙醛酸循環(huán)，明顯降低乙酸的積累；過表達sdhC或mdh基因可以降低2,3-丁二醇和乙醇的合成，緩解丙酮酸和乙酰輔酶A節(jié)點處的碳流積累。共表達sdhC和mdh基因可以提高菌株的甘油利用能力，弱化副產(chǎn)物合成，進一步提高碳流流向乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)，為細胞生長和1,3-PDO的合成提供能量和還原力。最終，在5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵中，K.pLric-sdhC-mdh的1,3-PDO產(chǎn)量提高了42%。綜上可知，激活乙醛酸循環(huán)和強化TCA循環(huán)可以弱化乙酸溢流問題，有利于細胞生長和1,3-PDO的合成，為改造K.pneumoniae合成1,3-PDO提供了研究思路。