田貴金 劉軍紅 陳 晶 張小龍 楊志森

河北省邯鄲市第一醫(yī)院綜合外科1(056002) 河北省武安市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科2

背景：肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人們生命健康。目前，越來(lái)越多研究證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在癌癥發(fā)生、進(jìn)展中的作用。目的：探討LncRNA FEZF1-AS1靶向miR-1254調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。方法：采用qRT-PCR法檢測(cè)肝癌組織和細(xì)胞株中FEZF1-AS1和miR-1254表達(dá)。將肝癌Hep3B細(xì)胞分為NC組、si-Lnc FEZF1-AS1組、si-con組、miR-1254組、miR-con組、si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-con組、si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-1254組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證FEZF1-AS1與miR-1254的靶向調(diào)控關(guān)系，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：肝癌組織和3種肝癌細(xì)胞株中FEZF1-AS1表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁組織和正常細(xì)胞，miR-1254表達(dá)顯著降低。轉(zhuǎn)染si-Lnc FEZF1-AS1或miR-1254 mimics均可顯著抑制Hep3B細(xì)胞Ki-67、N-cadherin和Vimentin表達(dá)，促進(jìn)cleaved caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，抑制EMT發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。FEZF1-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-1254表達(dá)。轉(zhuǎn)染si-Lnc FEZF1-AS1可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化。轉(zhuǎn)染anti-miR-1254可逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染si-Lnc FEZF1-AS1對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、EMT、凋亡以及PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。結(jié)論：LncRNA FEZF1-AS1在肝癌患者中的表達(dá)上調(diào)。沉默LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)靶向miR-1254抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及EMT發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化有關(guān)。

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。目前，手術(shù)切除和肝移植是肝癌早期的主要治療策略，但由于肝癌細(xì)胞迅速生長(zhǎng)且具有高侵襲性，多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已處于晚期[2]。盡管索拉非尼和程序性死亡受體-1(PD-1)抑制劑等在肝癌治療中取得了較好的療效，但患者的長(zhǎng)期生存率仍較低[3-5]。因此，開(kāi)發(fā)新的肝癌治療方法至關(guān)重要。最近研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)FEZ家族鋅指1反義RNA1(FEZF1-AS1)是人類(lèi)癌癥發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。FEZF1-AS1在胃癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其異常表達(dá)與患者的臨床特點(diǎn)有關(guān)，并通過(guò)多種潛在機(jī)制調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移[6]。有研究顯示FEZF1-AS1通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[7]，但FEZF1-AS1調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚未完全闡明。MiR-1254是一種癌癥相關(guān)基因，有研究證實(shí)miR-1254在胃癌中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-1254可明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[8]。LncRNA DCST1反義RNA1(DCST1-AS1)通過(guò)吸附miR-1254調(diào)控FAIM2表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[9]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示miR-1254是FEZF1-AS1的潛在靶基因，但目前仍未明確FEZF1-AS1是否通過(guò)調(diào)控miR-1254表達(dá)影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為。本研究通過(guò)在肝癌細(xì)胞中干擾FEZF1-AS1或miR-1254表達(dá)，旨在探討FEZF1-AS1在肝癌中的生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

收集2015年3月—2018年10月于邯鄲市第一醫(yī)院進(jìn)行外科手術(shù)切除的原發(fā)性肝癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織56例。其中男30例，女26例；年齡35～65歲，中位年齡58歲。診斷依據(jù)肝穿刺活檢、CT檢查等確診。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)化療、放療等抗腫瘤治療。手術(shù)切除的標(biāo)本-80 ℃保存。

人肝永生化細(xì)胞THLE-2、肝癌細(xì)胞株Hep3B、Huh7、MHCC97L購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；MTT試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、TRIzol試劑、BCA試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FEZF1-AS1小干擾RNA(si-Lnc FEZF1-AS1)、小干擾RNA對(duì)照(si-con)、miR-1254模擬物(miR-1254 mimics)、模擬物對(duì)照(miR-con)、miR-1254抑制物(anti-miR-1254)、抑制物對(duì)照(anti-miR-con)、空載體質(zhì)粒(pcDNA)、FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-FEZF1-AS1)、野生型螢光素酶報(bào)告基因載體(WT-FEZF1-AS1)以及突變型螢光素酶報(bào)告基因載體(MUT-FEZF1-AS1)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；鼠源Ki-67、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。兔源cleaved caspase-3抗體、鼠源PI3K抗體、兔源AKT抗體、二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；兔源p-PI3K抗體和兔源p-AKT購(gòu)于美國(guó)CST公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THLE-2細(xì)胞，采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)肝癌Hep3B、Huh7和MHCC97L細(xì)胞，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將si-Lnc FEZF1-AS1、si-con、miR-1254 mimics、miR-con轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，依次記為si-Lnc FEZF1-AS1組、si-con組、miR-1254組、miR-con組。轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，隨后行后續(xù)研究。將正常培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞作為NC組。為進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNA FEZF1-AS1是否通過(guò)調(diào)控miR-1254表達(dá)來(lái)影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，將si-Lnc FEZF1-AS1分別與anti-miR-con、anti-miR-1254共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，分別記為si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-con組、si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-1254組，轉(zhuǎn)染48 h，檢測(cè)細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。

3. qRT-PCR法檢測(cè)FEZF1-AS1和miR-1254表達(dá)：收集肝癌組織、癌旁組織、THLE-2細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、MHCC97L細(xì)胞以及各組轉(zhuǎn)染后的Hep3B細(xì)胞，以TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行qRT-PCR。FEZF1-AS1引物上游：5’-AGA GGC TAT GAC TCA GGG TT-3’，下游：5’-TGT TGC TCC ACA GTA AAG GT-3’；內(nèi)參β-actin引物上游：5’-GCA TCG TCA CCA ACT GGG AC-3’，下游：5’-ACC TGG CCG TCA GGC AGC TC-3’；miR-1254引物上游：5’-AGC CTG GAA GCT GGA GCC TGC AGT-3’，下游：5’-GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C-3’；內(nèi)參U6引物上游：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

4. MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力：將各組Hep3B細(xì)胞按2×103個(gè)/孔接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清液，再向每孔加入150 μL DMSO，繼續(xù)孵育2 h，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值(用空白孔進(jìn)行調(diào)零)。

5. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染48 h，胰酶消化后離心收集各組細(xì)胞，PBS洗滌，加入結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)1×106個(gè)/mL。吸取100 μL細(xì)胞懸液加入流式管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min。每管加入400 μL 結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

6. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力：轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，PBS洗滌，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL。取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室，500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入24孔板下室，常規(guī)培養(yǎng)12 h。用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，行0.1%結(jié)晶紫染色，將Transwell小室倒置于顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，取均值。

采用包被基質(zhì)膠的小室，使用前將小室放入24孔板，向上室加入300 μL預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15 min，使基質(zhì)膠水化后吸去剩余培養(yǎng)液。其余步驟同上述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，取均值。

7. 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含F(xiàn)EZF1-AS1-3’-UTR的WT-FEZF1-AS1以及MUT-FEZF1-AS1分別與miR-1254 mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，48 h后根據(jù)雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定Hep3B細(xì)胞的螢光素酶活性。隨后將si-con、si-Lnc FEZF1-AS1、pcDNA、pcDNA-FEZF1-AS1分別轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，以qRT-PCR法檢測(cè)miR-1254表達(dá)變化。

8. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)：提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入Ki-67(工作濃度1∶500)、cleaved caspase-3(工作濃度1∶500)、E-cadherin(工作濃度1∶500)、N-cadherin(工作濃度1∶500)、Vimentin(工作濃度1∶500)、鼠源PI3K(工作濃度1∶1 000)、兔源p-PI3K(工作濃度1∶1 000)、兔源AKT(工作濃度1∶500)、p-AKT抗體(工作濃度1∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗(工作濃度1∶1 000)，ECL顯影，曝光，攝片，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)和Image J軟件分析各條帶灰度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、LncRNA FEZF1-AS1和miR-1254在肝癌患者和細(xì)胞株中的表達(dá)

與癌旁組織相比，肝癌組織中FEZF1-AS1表達(dá)顯著升高，miR-1254表達(dá)顯著降低(P<0.05；表1)。與THLE-2細(xì)胞相比，3種肝癌細(xì)胞(Hep3B、Huh7、MHCC97L)中FEZF1-AS1表達(dá)顯著升高，而miR-1254表達(dá)顯著下降(P<0.05；表2)。其中FEZF1-AS1在Hep3B細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較高，因而選擇Hep3B細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

二、沉默LncRNA FEZF1-AS1可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

表1 LncRNA FEZF1-AS1和miR-1254在肝癌患者組織中的表達(dá)

表2 LncRNA FEZF1-AS1和miR-1254在正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

與si-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1組FEZF1-AS1表達(dá)顯著下降(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。與si-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1組Hep3B細(xì)胞在24、48、72 h的細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Ki-67蛋白表達(dá)顯著降低，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05；表3)。

三、沉默LncRNA FEZF1-AS1可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲和EMT發(fā)生

與si-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1組Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05；表4)。

四、LncRNA FEZF1-AS1靶向調(diào)控miR-1254表達(dá)

利用靶基因預(yù)測(cè)軟件DIANA發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1的3’-UTR與miR-1254存在部分互補(bǔ)序列(圖1)。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-1254 mimics+WT-FEZF1-AS1共轉(zhuǎn)染組螢光素酶活性顯著低于miR-con+WT-FEZF1-AS1共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；miR-1254 mimics+MUT-FEZF1-AS1共轉(zhuǎn)染組螢光素酶活性與miR-con+MUT-FEZF1-AS1共轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異(表5)。qRT-PCR法結(jié)果顯示，與si-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1組miR-1254表達(dá)顯著升高；與pcDNA組相比，pcDNA-FEZF1-AS1組miR-1254表達(dá)顯著降低(P<0.05；圖2)。說(shuō)明LncRNA FEZF1-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-1254表達(dá)。

五、過(guò)表達(dá)miR-1254抑制肝癌細(xì)胞Hep3B增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

與miR-con組相比，miR-1254組miR-1254表達(dá)顯著升高(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。與miR-con組相比，miR-1254組24、48、72 h的Hep3B細(xì)胞活力顯著降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Ki-67、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低，cleaved caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05；表6、表7)。

表3 沉默 LncRNA FEZF1-AS1可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

表4 沉默LncRNA FEZF1-AS1可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲和EMT發(fā)生

圖1 LncRNA FEZF1-AS1與miR-1254存在互補(bǔ)序列

表5 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

*與si-con組比較，P<0.05；#與pcDNA組比較，P<0.05

六、干擾miR-1254可部分逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA FEZF1-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3B的影響

與si-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1組miR-1254表達(dá)顯著升高，24、48、72 h的細(xì)胞活力顯著降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Ki-67、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著降低，cleaved caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高；與si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-1254組miR-1254表達(dá)顯著降低，24、48、72 h的細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Ki-67、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)顯著升高，cleaved caspase-3和E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05；表8、表9)。

七、干擾miR-1254可部分逆轉(zhuǎn)沉默LncRNA FEZF1-AS1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

與si-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1組肝癌細(xì)胞p-PI3K和p-AKT表達(dá)顯著降低；與si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-con組相比，si-Lnc FEZF1-AS1+anti-miR-1254組p-PI3K和p-AKT表達(dá)顯著升高(P<0.05；圖3)。

討 論

肝癌是一種全球性常見(jiàn)腫瘤，具有癥狀不典型、惡性程度高、侵襲轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差等特點(diǎn)。肝癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路。闡明肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制對(duì)開(kāi)發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。

表6 過(guò)表達(dá)miR-1254可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

表7 過(guò)表達(dá)miR-1254可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲和EMT發(fā)生

表8 干擾miR-1254和沉默F(xiàn)EZF1-AS1對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表9 干擾miR-1254和沉默F(xiàn)EZF1-AS1對(duì)肝癌Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲和EMT發(fā)生的影響

1 Da=0.992 1 u

LncRNA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳學(xué)水平調(diào)控基因表達(dá)，廣泛參與疾病進(jìn)展的調(diào)節(jié)。近年來(lái)，隨著對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制的深入研究，已發(fā)現(xiàn)多種具有預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后潛力的LncRNA。Pan等[10]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌中LncRNA PDPK2P高表達(dá)且與患者的病理特征和嚴(yán)重程度有關(guān)；Yang等[11]的研究表明LncRNA SNHG7表達(dá)升高與進(jìn)展期肝癌、腫瘤分級(jí)和血管浸潤(rùn)呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)；LncRNA PVT1表達(dá)上調(diào)是進(jìn)行肝切除和肝移植患者復(fù)發(fā)的標(biāo)志[12]。最近研究[13]指出，F(xiàn)EZF1-AS1在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制FEZF1-AS1表達(dá)可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和增殖能力，抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織和細(xì)胞中FEZF1-AS1表達(dá)顯著升高，沉默F(xiàn)EZF1-AS1可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)移是癌癥的惡性生物學(xué)行為之一，EMT是誘導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過(guò)程。EMT發(fā)生后上皮表型標(biāo)志物表達(dá)下降，間充質(zhì)表型標(biāo)志物增多[14]。本研究結(jié)果顯示沉默F(xiàn)EZF1-AS1可抑制肝癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。由此可見(jiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1在肝癌中具有致癌作用，但發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。

近年研究發(fā)現(xiàn)LncRNA通過(guò)發(fā)揮miRNA海綿的作用，降低靶miRNA表達(dá)間接調(diào)控基因或mRNA功能。已有研究證實(shí)FEZF1-AS1在口腔鱗癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌等多種癌癥中與不同miRNA包括miR-196a、miR-107、miR-30a等相互作用調(diào)控腫瘤進(jìn)展[15-17]。通過(guò)靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-1254是FEZF1-AS1的靶基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-1254表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-1254可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力以及EMT發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與沉默F(xiàn)EZF1-AS1的抗腫瘤作用相一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-1254表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)EZF1-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、EMT發(fā)生以及凋亡的影響。提示FEZF1-AS1可能通過(guò)靶向miR-1254在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用。與Chen等[9]發(fā)現(xiàn)DCST1-AS1通過(guò)吸附miR-1254促進(jìn)肝癌進(jìn)展的結(jié)果基本一致。

PI3K/AKT信號(hào)通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)EZF1-AS1后p-PI3K和p-AKT表達(dá)顯著降低，PI3K/AKT信號(hào)通路受到抑制，而干擾miR-1254表達(dá)則逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)EZF1-AS1對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。表明FEZF1-AS1通過(guò)吸附miR-1254調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)參與肝癌進(jìn)展。

綜上所述，LncRNA FEZF1-AS1在肝癌中表達(dá)上調(diào)，miR-1254表達(dá)下調(diào)。沉默LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)調(diào)控miR-1254表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化有關(guān)。上述研究結(jié)果為闡述肝癌發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的見(jiàn)解，為肝癌治療提供了新的方向。