黃則華 梅啟享 黃春蘭 陸穎影 曾 悅

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(201620)

背景：研究表明，腸屏障功能障礙與急性壞死性胰腺炎(ANP)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目的：探討L-精氨酸誘導(dǎo)的ANP小鼠腸屏障損傷及其加重ANP的機(jī)制。方法：將30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)和ANP組。ANP組小鼠給予腹腔注射8%L-精氨酸(4.5 g/kg)共兩次，間隔為1 h；SO組則腹腔注射等體積0.9% NaCl溶液。造模24 h、48 h和72 h后處死小鼠，行HE染色評(píng)估胰腺和腸道病理學(xué)評(píng)分，檢測(cè)血清淀粉酶、脂肪酶水平，以ELISA法評(píng)估炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和腸道通透性(DAO、D-乳酸、LPS)水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰腺組織和腸道組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)。結(jié)果：與SO組相比，ANP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)胰腺組織和回腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著增高(P<0.05)，血清淀粉酶、脂肪酶、炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、腸道通透性指標(biāo)(DAO、D-乳酸、LPS)水平均顯著增高(P<0.05)，胰腺組織和回腸組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)。結(jié)論：L-精氨酸誘導(dǎo)的ANP小鼠腸道通透性增加，LPS釋放增多，可能通過(guò)激活TLR4-MyD88信號(hào)通路促進(jìn)腸道、全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重ANP。

重度急性胰腺炎(SAP)是一種高死亡率的危重急癥，其腸屏障功能障礙是促進(jìn)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)等發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[1]。有研究表明，AP的腸屏障功能障礙可導(dǎo)致腸道菌群失衡移位，可反過(guò)來(lái)加重AP[2]。L-精氨酸腹腔內(nèi)注射是誘導(dǎo)小鼠ANP模型的重要方法之一，但對(duì)其腸道損傷的研究較少見(jiàn)。本研究通過(guò)給予小鼠腹腔內(nèi)注射L-精氨酸制備ANP模型，觀察其胰腺損傷和腸屏障功能障礙，旨在探討腸屏障損傷加重ANP的機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002]，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g；分籠飼養(yǎng)，每籠5只，于22～26 ℃動(dòng)物房飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。L-精氨酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，TNF-α、IL-6、IL-1β、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸和脂多糖(LPS)ELISA試劑盒均購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司。兔抗鼠多克隆抗體Toll樣受體4(TLR4)、兔抗鼠多克隆抗體髓樣分化因子88(MyD88)以及兔抗鼠多克隆抗體內(nèi)參Tubulin均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

二、研究方法

1. 模型建立和動(dòng)物分組：按數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SO組)和ANP組，并進(jìn)一步分為不同時(shí)間點(diǎn)亞組(24 h、48 h、72 h)，每組各5只。ANP組小鼠給予腹腔注射8% L-精氨酸(4.5 g/kg)2次，間隔1 h；SO組腹腔注射等體積0.9% NaCl溶液。造模結(jié)束后眼球取血，取胰腺組織和回腸末端組織，-80 ℃保存。

2. 病理學(xué)檢查：胰腺組織和回腸組織以4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片后行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理變化。胰腺組織病理學(xué)評(píng)分參考Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[3]，通過(guò)水腫、出血、壞死、炎癥浸潤(rùn)四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分；回腸組織病理學(xué)評(píng)分根據(jù)Chiu’s標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)黏膜損傷、炎癥反應(yīng)、充血、出血等方面進(jìn)行評(píng)分。

3. 血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)：各組小鼠麻醉后眼球取血，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，分離血清。采用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)血清淀粉酶和脂肪酶，采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)、腸道通透性(DAO、D-乳酸和LPS)水平，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：取胰腺組織和回腸組織，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，BCA法蛋白定量。取10 μg蛋白，行SDS-PAGE電泳，加入TLR4、MyD88一抗(工作濃度均為1∶1 000)，以Tubulin為內(nèi)參；加入二抗(工作濃度1∶4 000)；曝光，顯影，攝片。采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、組織病理學(xué)損傷

1. 胰腺病理?yè)p傷：SO組各時(shí)間點(diǎn)胰腺組織均未見(jiàn)明顯變化，偶見(jiàn)輕度葉內(nèi)間隔擴(kuò)張，無(wú)出血、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。ANP組24 h、48 h和72 h均可觀察到胰腺組織不同程度的水腫(葉內(nèi)、小葉內(nèi)、腺泡間、細(xì)胞間間隔增寬)、出血、腺泡壞死、炎性浸潤(rùn)等病理改變，且病理?yè)p傷隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重(P<0.05)。與SO組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ANP組病理學(xué)評(píng)分顯著增高(P<0.05；圖1)。

2. 腸道病理?yè)p傷：SO組各時(shí)間點(diǎn)回腸組織均未見(jiàn)明顯變化，偶見(jiàn)固有層輕度炎癥反應(yīng)、毛細(xì)血管充血，無(wú)黏膜破損等病理改變。ANP組24 h、48 h和72 h均可觀察到回腸組織不同程度的黏膜損傷，腸上皮和固有層內(nèi)充血、出血，腸上皮和固有層內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，且病理?yè)p傷呈時(shí)間依賴(lài)性(P<0.05)。與SO組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ANP組腸道病理學(xué)評(píng)分顯著增高(P<0.05；圖2)。

二、血清淀粉酶和脂肪酶水平

與SO組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ANP組血清淀粉酶和脂肪酶水平均顯著升高(P<0.05)，ANP組72 h血清淀粉酶和脂肪酶水平達(dá)峰值(圖3)。

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SO組比較，P<0.05

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SO組比較，P<0.05

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SO組比較，P<0.05

三、全身炎癥反應(yīng)和腸道通透性變化

1. 血清炎癥變化：ELISA分析顯示，與SO組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ANP組小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著增高(P<0.05)，且ANP組血清IL-6水平呈時(shí)間依賴(lài)性(P<0.05；圖4)。

2. 腸道通透性變化：與SO組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ANP組血清DAO水平顯著升高(P<0.05)，且呈時(shí)間依賴(lài)性(P<0.05)；ANP 48 h、72 h組血清LPS水平顯著增高(P<0.05)，72 h組血清D-乳酸水平顯著增高(P<0.05；圖5)。

四、胰腺和腸道TLR4-MyD88通路

與SO組相比，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ANP組胰腺和回腸組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)顯著增高，且呈時(shí)間依賴(lài)性(P<0.05；圖6)。

討 論

ANP是一種起病急、并發(fā)癥多、死亡率高的急腹癥，病理上以胰腺和胰周組織的局灶或彌漫性壞死、出血為主要特點(diǎn)，常以SIRS、MODS等并發(fā)癥為特征[5]。完整的腸屏障包括機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障；其中結(jié)構(gòu)、功能完整的腸黏膜上皮與細(xì)胞間緊密連接組成的腸機(jī)械屏障在維持正常腸屏障功能中發(fā)揮重要作用。ANP狀態(tài)下，腸道為最先受累的胰外器官之一，腸屏障功能障礙在SIRS和MODS的發(fā)病機(jī)制中起始動(dòng)作用[6]。腸屏障功能障礙與ANP的第2個(gè)死亡高峰密切相關(guān)，其可導(dǎo)致腸道菌群移位，促進(jìn)組織細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)釋放，誘發(fā)SIRS和MODS[7]。

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SO組比較，P<0.05

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SO組比較，P<0.05

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SO組比較，P<0.05

本實(shí)驗(yàn)采用L-精氨酸腹腔內(nèi)注射成功建立小鼠ANP模型，結(jié)果顯示ANP小鼠回腸組織病理?yè)p傷明顯，且呈時(shí)間依賴(lài)性，血清DAO、D-乳酸和LPS水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯升高，提示腸道通透性增加，導(dǎo)致腸屏障功能障礙。這與Fishman等[8]在ANP小鼠模型中發(fā)現(xiàn)腸黏液層破壞以及腸道通透性增加的研究結(jié)果基本一致。

ANP病理情況下，腸道屏障功能障礙的發(fā)生機(jī)制包括缺血再灌注損傷、微循環(huán)障礙、炎性介質(zhì)過(guò)度釋放、腸上皮細(xì)胞損傷、腸道菌群失調(diào)等[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)ANP小鼠胰腺組織和腸道組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)較SO組明顯上調(diào)，72 h時(shí)最為明顯，提示在ANP病理?xiàng)l件下，TLR4-MyD88信號(hào)通路被激活。TLR4是一種通過(guò)識(shí)別LPS結(jié)合宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體，通過(guò)MyD88依賴(lài)性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非MyD88依賴(lài)性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳遞信號(hào)[12]。在生理?xiàng)l件下，腸上皮細(xì)胞TLR4低表達(dá)，但在病理狀態(tài)下(如腸道缺血再灌注損傷、炎癥性腸病等)，TLR4水平顯著增高[13-16]，提示TLR4活化與腸道炎癥性損傷相關(guān)。Yoshiya等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可通過(guò)活化TLR4加重缺血再灌注誘導(dǎo)的腸道病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)TLR4-MyD88信號(hào)通路的激活可降低腸道緊密連接蛋白(如ZO-1、Occludin等)的表達(dá)，增加腸道通透性[18]。

綜上所述，在ANP狀態(tài)下，腸道菌群失調(diào)，促進(jìn)分泌LPS活化TLR4，激活TLR4-MyD88信號(hào)通路，加重腸道屏障功能障礙，從而進(jìn)一步加重ANP。但本研究結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實(shí)。