張熒熒，劉張淮，朱春艷，王曉英，管杰，王宇哲，王家軍

（寶應(yīng)縣水生動(dòng)物疫病與預(yù)防控制中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）是中國科學(xué)院水生生物研究所于1970 年代中后期至1980年代初，利用天然雌核發(fā)育的方正銀鯽為母本，以興國紅鯉為父本，經(jīng)人工繁育的一個(gè)異精雌核發(fā)育鯽魚養(yǎng)殖品種，由于異育銀鯽具有多種養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)，在1986 年就已經(jīng)作為淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種而在全國23 個(gè)省市得到推廣。近年來中科院水生所選育的異育銀鯽“中科3 號(hào)”、“中科5 號(hào)”加快了鯽魚養(yǎng)殖品種更新的速度，即便如此，異育銀鯽養(yǎng)殖過程中病害問題一直存在，近年來漸趨嚴(yán)重，極大影響了養(yǎng)殖異育銀鯽的經(jīng)濟(jì)效益[1]。

該試驗(yàn)對(duì)一養(yǎng)殖塘發(fā)病嚴(yán)重的鯽魚樣品進(jìn)行了病源細(xì)菌的分離鑒定，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期為防治鯽魚常見細(xì)菌性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

患病鯽魚采自寶應(yīng)縣廣洋湖鎮(zhèn)，平均體質(zhì)量125 g 左右。發(fā)病塘口放養(yǎng)鯽魚密度為每667 m2放養(yǎng)1 600 尾，混養(yǎng)少量花白鰱，4 月初鯽魚開始發(fā)病，出現(xiàn)赤皮、紅鰓、水霉病等癥狀。

1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；DNA 提取試 劑 盒 ；Protease K、DNA Marker2K、ddH2O 和2 ×EasyTay PCR SuperMix；動(dòng)物用藥敏分析試劑板。

1.3 儀器

潔凈工作臺(tái)、干式恒溫器、SHP-160 型生化培養(yǎng)箱、THZ-82B 型空氣搖床、MIKRO200R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、S1000 型PCR 儀、BG-Power 600 型電泳儀、INFINITY-3026 型凝膠成像系統(tǒng)、細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)。

1.4 病原菌分離

在無菌條件下使用無菌接種針蘸取鯽魚病灶部位于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行3 次分離純化，最終選取3 株優(yōu)勢(shì)菌。同時(shí)，將分離出的菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，于28 ℃空氣搖床中過夜培養(yǎng)，保存菌液。

1.5 細(xì)菌初步鑒定

觀察分離純化出來的3 株菌株形態(tài)，使用細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)分離出的3 株細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.6 DNA 提取

分離菌震蕩培養(yǎng)24 h 后，提取細(xì)菌DNA，按照DNA 提取試劑盒操作說明。

1.7 16 S rRNA 基因測序和分析

利用細(xì)菌16 S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。16 S rDNA 引物序列：F（5’-AAACTCAAAGGAATTGA CGG-3’）和R（5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’），參考彭宣憲等人方法[2]。PCR 反應(yīng)體系25 μL：SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性3 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，35 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取一部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠成像，觀察一下片段大小。剩下的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物股份有限公司進(jìn)行16 S rRNA 基因測序。

1.8 藥敏試驗(yàn)

使用動(dòng)物用藥敏分析試劑板檢測兩種細(xì)菌對(duì)8種常見抗生素的藥物敏感性，藥敏結(jié)果判定參照《抗微生物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（CLSI）[3]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

從患病鯽魚分離出3 株優(yōu)勢(shì)菌（圖1），菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長優(yōu)勢(shì)良好，分別編號(hào)GY-1-2、GY-1-3、GY-2-1。

2.2 細(xì)菌生物系統(tǒng)初步鑒定結(jié)果

將3 株菌株接種到生化反應(yīng)板上，放置到28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使用細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果如表1，初步鑒定GY-1-2 為棲稻黃色單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans），GY-1-3 為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），GY-2-1 為惡臭假單胞菌（P. putida）。

2.3 16 S rDNA 鑒定

利用細(xì)菌16 S rRNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠成像圖（圖2），片段大小在500 bp左右。將測序獲得的基因序列提交BLAST 進(jìn)行比對(duì)，如表2 所示，GY-1-3 與嗜水氣單胞菌的基因序列相似度最高，GY-1-2、GY-2-1 與假單胞菌的基因序列相似度最高。結(jié)合細(xì)菌自動(dòng)鑒定系統(tǒng)的初步鑒定結(jié)果，確定GY-1-2 為棲稻黃色單胞菌,GY-1-3為嗜水氣單胞菌，GY-2-1 為惡臭假單胞菌。

表1 細(xì)菌生物系統(tǒng)初步鑒定結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)

綜合匯總3 種菌的藥敏程度（表3），棲稻黃色單胞菌惡臭假單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶高度敏感。嗜水氣單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟 苯尼考和鹽酸多西環(huán)素5 種抗生素高度敏感。惡臭假單胞菌對(duì)恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素高度敏感。

表2 基因序列相似度

表3 菌株藥敏特性

3 討論

假單胞菌與嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然環(huán)境中和水生動(dòng)物體內(nèi)，棲稻黃色單胞菌、惡臭假單胞菌屬于革蘭氏陰性菌，是一種條件性致病菌。惡臭假單胞菌在人體的呼吸道和腸道也有分布，引起人的敗血癥等。該菌除了感染人之外，對(duì)多種水生動(dòng)物如兩棲類、魚類都有較強(qiáng)的感染性。對(duì)不同的水生動(dòng)物感染惡臭假單胞菌引起的癥狀與病理變化也有較大的差異[4-6]。該研究中感染的鯽魚病理癥狀為腸炎，解剖后腹腔有惡臭的氣味。嗜水氣單胞菌屬于氣單胞菌科，氣單胞菌屬。在池塘水質(zhì)變化，養(yǎng)殖魚體體質(zhì)下降時(shí)往往誘發(fā)疾病，給水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)造成損失。嗜水氣單胞菌易致鯽魚赤皮、皮膚潰爛、敗血癥急性死亡[7-8]。所以如何有效的抑制嗜水氣單胞菌與假單胞菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中尤為重要，該研究主要通過分離出的3 組細(xì)菌做藥敏試驗(yàn)，對(duì)比出抗菌效果較好的幾種藥物，指導(dǎo)養(yǎng)殖戶解決了目前鯽魚大批量死亡的問題。但在實(shí)際應(yīng)用過程中，這些藥物可能會(huì)受到溫度、環(huán)境污染物等多方面影響，要因地制宜地使用。當(dāng)然，長期濫用同一種抗生素藥物在消滅細(xì)菌的同時(shí)也造成耐藥性的問題也值得我們重點(diǎn)關(guān)注[9]，藥物只是起到輔助作用，在養(yǎng)殖過程中，做好預(yù)防管理工作才能獲得更好的經(jīng)濟(jì)效益。