資瓊濤 黃胥萊 陳東* 萬發(fā)春 沈維軍 易康樂 唐江權(quán) 李付強

（1，湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 410128；2，湖南畜牧獸醫(yī)研究所 410130；3，湖南天華實業(yè)有限公司 417000）

隨著人們收入水平的不斷提高，人們的消費從追求數(shù)量轉(zhuǎn)而追求質(zhì)量，牛肉以其高營養(yǎng)價值也漸漸受到消費者的青睞。肉牛體內(nèi)的肌內(nèi)脂肪沉積，不僅影響牛肉的斷面大理石評分，還可顯著提高牛肉的嫩度、多汁性和風味等感官品質(zhì)，從而最終影響其肉質(zhì)等級與經(jīng)濟價值[1]。脂肪沉積量主要取決于脂肪細胞的增殖和分化程度，這一過程受許多分化轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同調(diào)控作用，轉(zhuǎn)錄因子的表達量及其活性的大小決定了分化過程[2]。因此，研究湘西黃牛脂肪沉積調(diào)控的分子機制對品種選育具有重要意義。

GHRHR 屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族的成員之一，對動物機體的生長發(fā)育起關鍵作用，主要由GHRHR 基因調(diào)控分泌[3]。GHRHR 主要通過與GHRH 結(jié)合，以cAMP 為第二信使的信號通路激活垂體細胞合成并分泌GH，從而調(diào)控動物機體的生長發(fā)育[4]。張存芳等[5]等用PCR-SSCP 和DNA 測序鑒定GHRHR-5'UTR 中的一個新的單核苷酸多態(tài)性（NM_181020：c.102C＞T），發(fā)現(xiàn)該位點與紐約牛6 個月的體重（BW）顯著相關。劉艷麗[6]等對西農(nóng)薩能奶山羊和關中奶山羊的GHRHR基因進行研究時發(fā)現(xiàn)，P3 位點上的多態(tài)性與西農(nóng)薩能奶山羊的身高和體長相關性顯著，與關中奶山羊的胸圍、身高和體長顯著相關。這些研究都表明，GHRHR 基因?qū)游餀C體體重、身高等都有重要的影響?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，本研究旨在研究GHRHR 基因在湘西黃牛不同組織中的發(fā)育性表達，為改善牛肉品質(zhì)及選育優(yōu)良品種提供可借鑒的遺傳學資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼養(yǎng)管理

分別選取湖南德農(nóng)牧業(yè)集團有限公司國家級湘西黃牛保種場6、18 月齡和30 月齡湘西黃牛各10 頭。試驗牛在4 月齡時斷奶，每日精補料按照體重0.5%飼喂，精補料由55%玉米、豆粕24%、小麥麩15%、預混料4%、食鹽0.5%、小蘇打0.5%和碳酸氫鈣1%，其中每千克預混料含VA162.5K IU，VD25K IU，VE500 IU，碘12.5mg，鈷2.5mg，銅250mg，鐵125mg，鋅750mg，錳1g，硒7.5mg。于每天的07:00 和14:30 進行飼喂，先粗后精，粗料由稻草組成，粗料自由采食，自由飲水。所有試驗牛均健康無病，免疫程序一致，并進行統(tǒng)一管理。

1.2 屠宰及樣品采集

在6、18 和30 月齡試驗牛中隨機挑選4 頭體況和體重相近的牛，空腹后于晨飼前進行屠宰取樣，分別采集肝臟、12～13 肋骨背最長肌、皮下脂肪和腹腔脂肪4 個組織的樣品，迅速放入液氮中保存，之后置于實驗室-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑

TRIzol 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）、熒光定量試劑盒（百泰克）；氯仿和無水乙醇均購自康為世紀生物有限公司。

1.4 引物設計及合成

表1 實時定量PCR 引物序列

根據(jù)GenBank 中牛GHRHR 基因序列，采用Primer Premier 5.00 軟件設計特異引物，以牛GAPDH 和β-actin 基因作為內(nèi)參，由上海生工生物股份有限公司設計合成實時定量PCR 引物，引物序列見表1。

1.5 總RNA 提取及cDNA 第一條鏈合成

取約50mg 的組織樣，置于液氮中研磨之后，用Trizol 法(Thermo Fisher Scientific 公司) 提取總RNA。用超微量紫外分光光度計檢測其濃度和OD 值（OD260nm/OD280nm=1.8～2.0）。用超微量分光光度計定量，OD260nm/OD280nm值均在1.82～2.04 之間，說明提取的總RNA 純度較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）說明書將總RNA（1ug）反轉(zhuǎn)成cDNA。20uL 體系，反應條件為：65℃ 5min，42℃60min，25℃5min，70℃5min，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 置于-80℃冰箱保存。

1.6 實時熒光定量PCR

采用SYBR Green 熒光染料法在實時熒光定量PCR 儀上進行定量。反應體系（20ul）：2×Fast SYBR.Green Master Mix 10μL，cDNA 1μL，無菌水8μL，下游引物0.5μL 和上游引物0.5μL。反應條件：95℃15s，95℃5s，60℃30s，95℃60s，60℃60s，40 個循環(huán)后進行溶解曲線分析，以每5s 上升0.5℃的速率從65℃升高到95℃，熒光信號在循環(huán)結(jié)束時檢測，每個樣品做3 個重復。PCR 反應產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7 統(tǒng)計分析

實時熒光定量PCR 得出的基因原始表達量用2-△△Ct法計算，2-△△Ct表示試驗目的基因mRNA 的相對表達量。利用SAS 9.0 軟件one-way ANOVA 程序進行統(tǒng)計分析，表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 GHRHR 基因在不同月齡湘西黃牛的相同組織中發(fā)育性表達的差異

由表2 可知，湘西黃牛在18 月齡GHRHR 基因的表達量極顯著高于6 月齡和30 月齡GHRHR 基因的表達量30 月齡GHRHR 基因的表達量極顯著高于6 月齡

2.2 GHRHR 基因在相同月齡湘西黃牛不同組織中的表達差異

由表3 可知，GHRHR 基因在6 月齡的湘西黃牛各組織中的表達量差異不顯著在18 月齡時，背最長肌與皮下脂肪中GHRHR 基因的表達量顯著高于肝臟中的表達量30 月齡時，各組織中的表達量兩兩之間差異顯著且皮下脂肪＞背最長?。靖骨恢荆靖闻K。

表2 GHRHR 基因在不同月齡湘西黃牛中的表達差異

表3 GHRHR 基因在湘西黃牛不同組織中的發(fā)育性表達

3 討論

Wang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，GHRHR 基因的表達主要局限于垂體或大腦。王英明等[8]以瀘寧雞和羅斯白羽肉雞為研究對象，發(fā)現(xiàn)GHRHR 基因主要在垂體中表達，在其他組織上極少表達或基本不表達。本研究發(fā)現(xiàn)，GHRHR 基因在湘西黃牛脂肪代謝關鍵部位均有表達，隨著月齡的增加，GHRHR 基因的表達量先增加后減少，在18 月齡的表達量達到最高，說明GHRHR基因的表達與湘西黃牛生長發(fā)育階段有關，且GHRHR 基因在各組織的表達存在月齡間差異性。在6 月齡時，各組織間GHRHR 基因的表達量無顯著差異；而18 月齡和30 月齡時肝臟中GHRHR 基因的表達量最低，皮下脂肪最高，且各組織間GHRHR 基因的表達量存在顯著差異，這說明GHRHR 基因的表達量存在組織差異性。

研究表明，GHRHR 基因在生殖系統(tǒng)中受GH 基因的調(diào)控發(fā)揮生物學功能[9]。脂肪沉積與脂肪細胞的發(fā)生、脂肪合成和脂解作用有關，GH 可促進脂類分解，抑制脂肪的合成[10,11]。Straus 等[12]研究報道GH 可誘導前脂肪細胞系（3T3-L1、3T3-F442A 和Ob1771）中的前脂肪細胞分化為脂肪細胞，促進脂肪生成。而Wabitsch 等[13]在體外原代培養(yǎng)脂肪的前體細胞試驗中發(fā)現(xiàn)，GH 顯著降低新脂肪細胞的生成，且劑量依賴性的降低甘油3-磷酸脫氫酶的活性，抑制脂肪的生成。上述研究表明，GH 對脂肪生成的影響與其對脂肪的合成和分解作用存在一定差異性。Alba 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GHRHR 敲除小鼠的體重、肝臟重、腎臟重和心臟重均低于正常小鼠。張海波等[15]通過敲除小鼠皮下脂肪組織的CD29 和CD34 基因相對表達量的測定發(fā)現(xiàn)，GHRHR 基因可以增加干細胞的增殖，促進脂肪沉積。上述研究表明，GHRHR 基因在動物機體生長發(fā)育及脂肪代謝過程中發(fā)揮重要作用。本研究初步探討了6 月齡、18 月齡和30 月齡湘西黃牛脂肪代謝關鍵部位GHRHR 基因的表達規(guī)律，對GHRHR 基因與牛脂肪沉積之間的關系有待進一步探究。

4 結(jié)論

GHRHR 基因在6 月齡、18 月齡及30 月齡湘西黃牛脂肪代謝關鍵部位均有表達，且差異顯著，存在月齡和組織間的差異性。GHRHR 基因?qū)ο嫖鼽S牛機體脂質(zhì)代謝具有重要作用，為湘西黃牛品種選育及肉質(zhì)改善奠定了基礎。