孟衛(wèi)芹 陳金龍 姚春陽 王金良*

（1，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600；2，山東綠都生物科技有限公司 256600）

乳腺炎是奶山羊的常見病和多發(fā)病，會導致奶產量及品質的下降，給奶山羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失，并給人類公共衛(wèi)生安全帶來巨大隱患，山東省約1/4 的奶山羊患有乳腺炎，其中大部分為隱性乳腺炎，病原微生物感染及不合理的飼養(yǎng)管理是引起該病的主要病因[1]。引起羊乳房炎的病原微生物眾多，據(jù)報道有80 多種[2]，金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌及無乳鏈球菌是引起該病的主要病原菌[3,4]，其中無乳鏈球菌屬B 群鏈球菌，為重要的人畜共患致病菌之一，可導致嬰幼兒腦炎、敗血癥、肺炎、紅斑狼瘡等嚴重疾病[5]。筆者用傳統(tǒng)微生物學分離鑒定和藥敏試驗對該羊場中患病乳腺炎的山羊奶樣進行細菌分離鑒定，并對分離鑒定出的無乳鏈球菌進行耐藥性分析，旨在為該羊場無乳鏈球菌性乳房炎性的治療提供檢測數(shù)據(jù)的支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

山東省某羊場的疑似無乳鏈球菌性乳腺炎患病羊所產羊奶。

1.1.2 試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）為OXOID 公司產品；革蘭氏染色液購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；萘啶酸、多黏菌素、結晶紫購自上海華藍科技有限公司，細菌DNA 提取試劑盒及Taq DNA 聚合酶預混液購自北京百泰克生物科技有限公司，細菌微量發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；鏈球菌選擇性TSA 固體培養(yǎng)基經116℃高壓20 min，冷卻到45℃左右后加入無菌結晶紫0.2ug/ml、萘啶酸20ug/ml、多黏菌素3ug/ml 及5%的牛血清，普通瓊脂綿羊血平板按常規(guī)方法制備，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 奶樣的采集

采樣前先用溫水洗凈乳房并對其進行消毒處理，消毒后前期采集的乳汁棄掉，盡量無菌采樣，每個乳區(qū)收集5～10ml 于無菌樣品袋中，做好標記，奶樣收集完成置于冷藏并立即送往實驗室進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2.2 細菌的分離

超凈臺內用無菌接種環(huán)蘸取奶樣后劃線接種于選擇性TSA平板，于37℃培養(yǎng)24h 后觀察細菌的分離情況，并對分離菌進行革蘭氏染色、鏡檢，對疑似菌落接種普通瓊脂綿羊血平板觀察有無溶血現(xiàn)象。

1.2.3 生化試驗

將分離菌株分別接種于5%乳糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇等糖發(fā)酵試驗，同時馬尿酸鈉水解試驗、七葉苷水解試驗、過氧化氫酶試驗等，37℃培養(yǎng)24h，觀察生化反應特性并記錄試驗結果。

1.2.4 無乳鏈球菌的PCR 鑒定

1.2.4.1 模版的制備

取細菌培養(yǎng)物1.5ml，使用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA 存于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 無乳鏈球菌的PCR 鑒定引物

根據(jù)Radhan[6]等人設計的乳腺炎無乳鏈球菌鑒定引物ST-F:5′-GCTAGGCTCCATTGAATC-3′ P1:5′-GCTAGGCTCCATTGAATC-3′；P2:5′-TTAACCTAGTTTCTTTAAAACTAGAA-3′，預期擴增片段大小為162bp，并由安徽通用生物有限公司合成。擴增片段直接送安徽通用生物有限公司測序。

1.2.5 無乳鏈球菌藥敏試驗

將分離株細菌培養(yǎng)物稀釋后均勻涂布于含5%血清的TSA平板，選取相應抗生素的藥敏紙片貼于平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察并判定結果。

2 結果

2.1 細菌的分離

如圖1 可知，37℃培養(yǎng)24h 后在選擇性TSA 平板上形成圓形、灰白色、表面光滑濕潤、微凸、邊緣整齊的菌落。革蘭氏染色為陽性球菌，成對或短鏈狀存在。在普通瓊脂綿羊血平板上有溶血現(xiàn)象。

2.2 生化試驗

生化試驗表明，該分離菌發(fā)酵5%的乳糖、海藻糖，不發(fā)酵棉糖、菊糖、山梨醇、甘露醇，馬尿酸鈉水解試驗為陽性，七葉苷水解試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陰性，CAMP 試驗為陽性。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》該分離菌為無乳鏈球菌。

2.3 無乳鏈球菌的PCR 鑒定

PCR 鑒定結果顯示在162bp 位置出現(xiàn)目的條帶（圖2），測序結果與NCBI 上公布的無乳鏈球菌序列同源性在99.8%以上。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗表明分離株對氟苯尼考、頭孢噻夫、恩諾沙星敏感，而對環(huán)丙沙星、磷霉素、阿莫西林、慶大霉素、硫酸卡那霉素、新霉素、多西環(huán)素耐藥。

3 討論

山羊乳腺炎多數(shù)為隱性乳房炎，無明顯的臨床癥狀或病理變化輕微，但在氣溫驟降、飼養(yǎng)管理不善等應激條件下會轉變?yōu)榕R床型乳腺炎，危害嚴重，目前隱性乳腺炎的治療主要以抗生素治療為主。雖然抗生素在臨床上發(fā)揮了巨大的作用，但在治療中濫用抗生素的情況日益嚴重，導致抗生素殘留和耐藥菌株的出現(xiàn)，使得治療效果下降，不僅增加治療成本，而且會導致奶制品品質下降。本試驗分離臨床無乳鏈球菌時，在培養(yǎng)基中添加萘啶酸、多黏菌素和結晶紫，其中萘啶酸和多粘菌素B對大腸桿菌、變形桿菌、嗜血桿菌等革蘭氏陰性菌具有抑菌或殺菌作用，結晶紫可以抑制乳樣中金黃色葡萄球菌的生長，大大提高無乳鏈球菌的分離效率。乳腺炎致病菌的分離鑒定及藥敏試驗可以篩選出有效的治療藥物，這對獸醫(yī)臨床上治療羊乳腺炎具有重要的指導作用。