付應霄，毛穎基，牛德群，黃銀久

(1.蚌埠醫(yī)學院生命科學學院，安徽蚌埠 233030；2.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院)

人體骨量的維持有賴于破骨細胞(osteoclast)主導的骨骼吸收過程以及成骨細胞(osteoblast)主導的骨骼形成過程[1]。機體骨骼吸收異常加劇則易導致其總量流失過度，進而可能引發(fā)骨質疏松癥、Paget’s，類風濕性關節(jié)炎等溶骨性疾病[2]。骨骼吸收的速率一定程度上取決于破骨細胞的數(shù)量與蝕骨功能，然而其數(shù)量與蝕骨功能受多種復雜因素的調節(jié)，因此，確定相關因素及其作用機理顯得尤為關鍵。

microRNAs能夠調控破骨細胞分化與活性[3]，但該領域研究尚待深入。筆者前期通過miRNA表達譜分析(由中國上海KangChen Bio-tech完成)發(fā)現(xiàn)，與破骨細胞前體相比較，分化破骨細胞內miR-185-3p 表達水平上調極顯著(P<0.01)，此結果提示，miR-185-3p可能影響破骨細胞的分化過程，本研究將系統(tǒng)研究miR-185-3p對破骨細胞形成的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1RAW264.7細胞株 購自中科院細胞庫(上海生命科學研究院)。

1.1.2主要試劑 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)與MEM-α (Minimum essential medium α)細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(GE Healthcare，美國)；M-CSF(Macrophage colony stimulating factor，巨噬細胞集落刺激因子)、RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，核因子 kappa-B 活化因子配基) (PeproTech，美國)；TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase，抗酒石酸酸性磷酸酶)染色試劑盒(Sigma-Aldrich，美國)；COAS(Corning Osteo Assay Surface)吸收活性分析多孔培養(yǎng)板；miRNA-185-3p引物、U6引物、All-in-One miRNA qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)檢測試劑盒(GeneCopoeia，美國)；Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen Corporation，美國)。

1.2方法

1.2.1破骨細胞誘導培養(yǎng) 復蘇RAW264.7細胞并培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基 (含10 % FBS、青霉素+鏈霉素)。取對數(shù)生長期RAW264.7細胞重懸于MEM-α培養(yǎng)液 (含10 % FBS、青霉素+鏈霉素)，并接種至細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)4 h，待細胞貼壁換含25 ng/mL M-CSF + 100 ng/mL RANKL的MEM-α培養(yǎng)液 (含10 %FBS、青霉素+鏈霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.2RNA提取與miR-185-3p表達水平檢測 培養(yǎng)結束，收集RAW264.7細胞與M-CSF + RANKL聯(lián)合誘導培養(yǎng)RAW264.7細胞(已分化細胞)，提取總RNA。測定并調整RNA濃度，運用All-in-One miRNA qRT-PCR檢測試劑盒進行逆轉錄獲取cDNA，并通過實時熒光定量PCR法檢測RAW264.7細胞與誘導分化細胞內miRNA-185-3p表達水平。

1.2.3miR-185-3p 模擬物(mimics)與阻遏物轉染(inhibitors) RAW264.7細胞接種并貼壁生長，運用Lipofectamine 2000 將miR-185-3p 模擬物與阻遏物轉染RAW264.7細胞，6 h后更換含M-CSF + RANKL的MEM-α培養(yǎng)液。

1.2.4TRAP染色及計數(shù) 實驗設置miR-185-3p 模擬物與阻遏物轉染的M-CSF + RANKL誘導組與M-CSF + RANKL誘導組。培養(yǎng)結束吸棄培養(yǎng)基，采用4 %多聚甲醛溶液固定細胞，10 min后棄去固定液，超純水清洗樣品，棄盡殘液，加入預配染色液，37 ℃染色50-60 min。染色結束，倒置顯微鏡觀察、拍照并計數(shù)≥3個核的破骨細胞。

1.2.5吸收活性檢測 實驗設置miR-185-3p 模擬物與阻遏物轉染的M-CSF + RANKL誘導組與M-CSF + RANKL誘導組。細胞接種于COAS培養(yǎng)板，培養(yǎng)結束。取COAS培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)基，超純水沖洗孔底。加入10 %次氯酸溶液，室溫放置5 min。超純水沖洗，自然晾干后倒置顯微鏡觀察吸收陷窩，并計算面積。

2 結果

2.1miR-185-3p表達水平變化 實時熒光定量PCR法檢測結果表明，M-CSF + RANKL誘導分化細胞內miRNA-185-3p表達水平顯著高于RAW264.7細胞(P<0.05)。該結果與前期miRNA表達譜分析實驗結果相符。見圖1，表1。

表1 分化破骨細胞與破骨細胞前體差異表達miRNA(mmu-miR-185-3p)

2.2miR-185-3p 影響破骨細胞分化形成 對各組細胞進行TRAP染色，結果可見分化形成的多核細胞體積大、鋪展明顯、胞質呈現(xiàn)酒紅色、胞核無色(圖2A)。細胞計數(shù)表明，與M-CSF+RANKL聯(lián)合誘導組(8.67±1.70)相比較，miR-185-3p模擬物轉染組(12.33±1.27)破骨細胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)，而miR-185-3p阻遏物轉染組(3.67±0.61)破骨細胞數(shù)量極顯著減少(P<0.01)(圖2B)。

2.3miR-185-3p 影響破骨細胞吸收活性 統(tǒng)計表明，miR-185-3p模擬物轉染組吸收陷窩面積(96 058.99±29 837.22)μm2顯著大于M-CSF+RANKL組的(34 985.92±13 440.78)μm2(P<0.05)，而miR-185-3p阻遏物轉染組(2 997.89±947.90)μm2則顯著小于M-CSF+RANKL組(P<0.05)。見圖3。

3 討論

破骨細胞形成與功能的關鍵鑒定指標是其分化形態(tài)與吸收活性[1]。本文發(fā)現(xiàn)miR-185-3p模擬物轉染組破骨細胞數(shù)量顯著增多吸收活性增強，而miR-185-3p阻遏物轉染組破骨細胞數(shù)量極顯著減少且吸收活性減弱。表明，miR-185-3p 能夠促進破骨細胞的分化形成。

Dgcr8(DGCR8, DiGeorge syndrome critical region gene 8)，Dicer和Ago2(Argonaute 2)是miRNAs維持穩(wěn)態(tài)和發(fā)揮功能的關鍵因素。通過小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)沉默破骨細胞前體中Dgcr8, Dicer, 或者Ago2基因，結果發(fā)現(xiàn)，破骨細胞的分化形成和功能均受到顯著影響。在miRNA缺陷的破骨細胞前體呈現(xiàn)出破骨細胞分化和活化的關鍵轉錄因子如PU.1，Mitf(microphthalmia-associated transcription factor)，F(xiàn)os和Nfatc1(nuclear factor of activated T cells)等表達水平下調的現(xiàn)象，表明miRNAs能夠影響破骨細胞的形成與活性[4]。

多種miRNAs可能通過調控破骨細胞分化與活化過程的靶基因或相應信號轉導途徑，進而影響破骨細胞的形成或功能。如hsa-miR-422a、hsa-miR-148a-3p、miR-31-5p、miR-29、miR-183-5p、miR-214-3p等可促進破骨細胞的分化和活化；而miR-26a-5p、miR-34a-5p、miR-124-3p、miR-125a-5p、miR-503-5p等則抑制破骨細胞的分化和活化；另外，miR-223-3p、hsa-miR-133a-3p、miR-21-5p等對破骨細胞的分化和活化兼具促進和抑制雙重影響[5]。但絕大部分miRNAs對破骨細胞分化與活化的調控機制仍亟待確定。

miR-185-3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已有報道多集中于miR-185-3p影響腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲與轉移等行為[6-7]。此外，miR-185-3p亦可參與細胞自噬的調控[8]。但尚無miR-185-3p調控破骨細胞分化與活化的相關報道。

筆者通過生物信息學方法，對mmu-miR-185-3p潛在靶基因進行預測，取miRWalk，miRanda，RNA22，Targetscan四個軟件預測結果交集，發(fā)現(xiàn)TRAF3為mmu-miR-185-3p的潛在靶基因之一。報道表明，TRAF 3能夠阻抑RANKL誘導的破骨細胞分化形成過程[9]。RANKL通過TRAF 2/cIAP 1/2誘導TRAF 3發(fā)生泛素化和溶酶體降解，釋放NIK以磷酸化激活IKK-α，引起蛋白酶體將p100加工成為p52。RelB：p52異二聚體進入細胞核誘導相關靶基因表達。TNF不降解TRAF 3，從而導致NIK被降解，導致破骨細胞前體細胞質中p100的積累，從而限制破骨細胞前體的分化[10]。

本文發(fā)現(xiàn)，miR-185-3p 可促進破骨細胞分化，推測其可能通過靶向調控破骨細胞前體的TRAF3基因(破骨細胞分化的負調控基因)，進而影響該細胞的形成，詳細機理尚待進一步研究。