王煥君 馬致潔 董捷鳴 吳昊 于小紅 段曉穎

摘要 目的：分析雷公藤配伍甘草減毒大鼠體內(nèi)尿液中的小分子代謝物以及相應(yīng)生物代謝通路。方法：選取30只SD大鼠正常飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組、雷公藤組、雷公藤配伍甘草組，每組10只。應(yīng)用HPLC-MS/MS-IT-TOF檢測(cè)各組大鼠的尿液樣本，并且按照偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以篩選并鑒定潛在的生物標(biāo)志物;在此基礎(chǔ)上推測(cè)其可能影響到的生物代謝通路。結(jié)果：大鼠尿液代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示，雷公藤配伍甘草組、雷公藤組和空百對(duì)照組分別聚集在不同的象限區(qū)域內(nèi);共鑒定出14個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，并且推測(cè)出嘌呤代謝和硒氨基酸代謝最具顯著影響。結(jié)論：雷公藤配伍甘草減毒的機(jī)制復(fù)雜，其中可能通過調(diào)控嘌呤代謝和硒氨基酸代謝通路而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞? 雷公藤;甘草;配伍減毒;尿液;代謝組學(xué);生物標(biāo)志物;代謝通路;中藥

Analysis of Toxicity Reduction on Tripterygium Wilfordii Combined with Radix Glycyrrhizae by Using Metabolomics of Rat Urine

WANG Huanjun¹，MA Zhijie²，DONG Jieming²，WU Hao²，YU Xiaohong²，DUAN Xiaoying³

（1 Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China; 2 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China; 3 The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Abstract Objective：To analyze the changes of small molecular metabolites in urine of rats administrated by tripterygium wilfordii combined with Radix Glycyrrhizae，and the involved metabolic pathways by metabolomics.Methods：On the basis of the previous experiment，the rats were given different experimental intervention，specifically divided into tripterygium wilfordii group，tripterygium wilfordii combined with Radix Glycyrrhizae group and blank control group; HPLC-MS/MS-IT-TOF was used to detect urine samples of rats in each group，and PLS-DA multivariate statistical method was used to screen and identify potential biomarkers.On this basis，it is speculated that it may affect the biological metabolic pathways.Results：The results of urine metabolomics analysis showed that the groups were clustered in different quadrants.We together identified 14 potential biomarkers and speculated that purine metabolism and selenoamino acid metabolism had the most significant effects.Conclusion：The mechanism of tripterygium wilfordii combined with Radix Glycyrrhizae is complex，which may be achieved by regulating purine metabolism and selenoamino acid metabolism pathway.

Keywords Tripterygium wilfordii; Radix glycyrrhiza; Compatibility toxin reduction; Urine; Metabolomics; Biomarkers; Metabolic pathway; Chinese medicine

中圖分類號(hào)：R282;R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.003〖HK〗

雷公藤載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性涼、味苦、有大毒、歸肝腎經(jīng)，具有抗炎[1]、抗腫瘤[2]、祛風(fēng)除濕、舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒的功效。在臨床上，雷公藤可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療，可發(fā)揮獨(dú)特的治療效果[3-5]。然而，伴隨雷公藤發(fā)生的嚴(yán)重不良反應(yīng)也是不可輕視的[6]，使其成為了近來(lái)出現(xiàn)中毒事件最多的中草藥之一，尤其是雷公藤導(dǎo)致的肝毒性更是居單味藥材肝損傷之首[7-8]。因此，針對(duì)于雷公藤的減毒存效研究是當(dāng)前研究的重中之重。自古以來(lái)，配伍和炮制作為中藥減毒增效的手段被廣泛應(yīng)用，如甘草能調(diào)和諸藥，可解百藥毒，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為藥之上品，遵照“肝苦急，急食甘以緩之”的肝證治則。文獻(xiàn)記載，甘草常用于有毒中藥的配伍及炮制[9]，從中醫(yī)臟象學(xué)說的角度來(lái)看，甘草能夠緩和峻烈藥物如雷公藤等的藥性，調(diào)和脾胃、護(hù)肝保肝?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)，雷公藤與甘草配伍后可以減輕其肝毒性，而且通過優(yōu)選配伍比例后分析其化學(xué)成分的改變[10]，但其確切的配伍減毒機(jī)制仍不明確。鑒于此，我們?cè)谇捌诠ぷ骰A(chǔ)上，進(jìn)一步通過偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）以探究雷公藤配伍甘草后引起的大鼠體內(nèi)尿液中內(nèi)源性代謝物的改變，從而推測(cè)其可能影響到的代謝通路，也為配伍減毒機(jī)制的闡明提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

選取SD（Sprague Dawley）大鼠30只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（180±20）g，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0004]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室內(nèi)保持12 h光照黑暗循環(huán)，動(dòng)物飼養(yǎng)使用的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水以及所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照解放軍302醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 藥物

雷公藤T.wilfordii生藥材購(gòu)自福建三明，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院趙奎君教授鑒定，為衛(wèi)矛科雷公藤的干燥根;生甘草飲片購(gòu)自于北京友誼醫(yī)院中藥房，經(jīng)趙奎君教授鑒定為豆科植物脹果甘草的干燥根。

參照前期研究的藥品制備方法，制備雷公藤提取物和雷公藤配伍甘草樣品[11]。

1.1.3 試劑與儀器

甲醇（色譜純，F(xiàn)isher，批號(hào)：710741），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher，批號(hào)：746105），甲酸（色譜純，F(xiàn)isher，批號(hào)：742317），LC-MS/MS-IT-TOF儀（日本島津公司，Shimad-zu型），Waters XBridge C]18色譜柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm），超純水器（美國(guó)Millipore公司，Gradient A10 Mill-Q型），超聲提取清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ5200E型），小型冷凍高速離心機(jī)離心機(jī)（Eppendorf，5424 R型）。

1.2 方法

1.2.1 分組

選取30只SD大鼠正常飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組、雷公藤組、雷公藤配伍甘草組，每組10只。

1.2.2 給藥方法

空白對(duì)照組給予生理鹽水、雷公藤組灌胃給藥雷公藤提取物15 g/kg、雷公藤配伍甘草組灌胃給藥雷公藤配伍甘草提取物15 g/kg，（以雷公藤生藥材計(jì)），連續(xù)給藥14 d（上午9：00-]10：00），于末次給藥后陸續(xù)收集大鼠的尿液。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

于大鼠給藥2周后收集尿液樣本，并置于-80 ℃冰箱保存，待測(cè)。檢測(cè)前將大鼠尿液于-80 ℃冰箱中取出，復(fù)融，取250 μL加入到1.5 mL EP管中，再加入甲醇溶液750 μL，混勻，靜置，4 ℃下冷凍離心（10 000 r/min，10 min），取上清，并用0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

采用Waters XBridge? C18色譜柱（3.5 μm，]2.1 mm×100 mm）色譜柱;柱溫為40 ℃，流速為]0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，樣品溫度為4 ℃;液相洗脫條件：流動(dòng)相A：水（1%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈（1%甲酸）。流動(dòng)相梯度設(shè)置為：0～3 min，95%A;]3～5 min，95%～50%A;5～8 min，50%A;8～]10 min，50%～30%A;10～20 min，30%A;20～]22 min，30%～5%A;22～25 min，5%A;25～27 min，5%～95%A;27～35 min，95%A。

質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：電離模式：ESI±;掃描范圍：]100～1 000 m/z;離子源電壓：4.5 kV;霧化器流量：1.5 L/min;干燥器（N2）：100 kPa;脫溶劑部溫度：200 ℃;Ion Accumulation Time：30 ms;CID Energy：50%;檢測(cè)器電壓1.80～2.10 kV。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Profiling solution軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和色譜峰識(shí)別，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件，標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行PLS-DA分析;運(yùn)用VIP變量排序來(lái)預(yù)測(cè)各個(gè)變量對(duì)于擬合模型的貢獻(xiàn)值，認(rèn)為VIP>1者具有顯著的貢獻(xiàn)。再采用One-Way ANOVA的方法，依據(jù)P<0.05的原則，進(jìn)一步排除上述潛在變量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者;最后，將篩選出的顯著差異性變量所對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比數(shù)值輸入至Human Metabolome Database（HMDB）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行匹配，進(jìn)而推測(cè)可能的生物標(biāo)志物;依據(jù)上述方法將尋找到的所有內(nèi)源性代謝物的相關(guān)信息依次導(dǎo)入MetaboAnalyst代謝組數(shù)據(jù)綜合分析平臺(tái)（https：//www.metaboanalyst.ca/），進(jìn)行代謝通路及富集分析。

2 結(jié)果

2.1 代謝輪廓分析

通過PLS-DA方法進(jìn)行模型擬合，該模型的擬合參數(shù)R2Y為0.999，Q2為0.876，顯示其準(zhǔn)確度和預(yù)測(cè)度均良好。從圖1中可以看出，雷公藤配伍甘草組（黑色圓圈）、雷公藤組（灰色圓圈）和空白對(duì)照組（白色圓圈）大鼠分別分布于不同的象限區(qū)域內(nèi)，而微觀體現(xiàn)在各組大鼠體內(nèi)的內(nèi)源性小分子代謝物水平的差異，進(jìn)而導(dǎo)致了各組大鼠宏觀上分布區(qū)域的不同。由此可知，雷公藤在大鼠體內(nèi)發(fā)揮毒性作用的同時(shí)，其對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性小分子代謝物的水平也發(fā)生了顯著性的改變;然而當(dāng)雷公藤與甘草配伍作用后，其在大鼠體內(nèi)的毒性作用逐漸減弱甚至消失，此時(shí)發(fā)生異常改變的內(nèi)源性小分子代謝物則表現(xiàn)出恢復(fù)正常水平的態(tài)勢(shì)，在宏觀上體現(xiàn)為接近空白對(duì)照組大鼠的區(qū)域內(nèi)移動(dòng)。

從圖2中可以看出，每一個(gè)白色圓圈標(biāo)識(shí)代表著不同的變量，其中距離坐標(biāo)軸中心點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量，其對(duì)模型擬合過程中各組分離度的貢獻(xiàn)越大，也就是說這個(gè)變量所對(duì)應(yīng)的潛在物質(zhì)在各組大鼠體內(nèi)的含量差異越大，即所謂的潛在生物標(biāo)志物（內(nèi)源性小分子代謝物）。圖3中顯示出不同變量的VIP重要性排序，VIP的數(shù)值越大，該變量在擬合模型中的顯著性就越顯著，通常我們選擇VIP值>1為該變量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)而完成后面的生物標(biāo)志物推測(cè)工作。

2.2 生物標(biāo)志物篩查

本研究共鑒定出14個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，見表1，以及VIP值、質(zhì)荷比、保留時(shí)間、標(biāo)志物種類、加合形式、誤差值及在各組大鼠尿液中的含量變化等信息。其中，與空白對(duì)照組比較，有4個(gè)生物標(biāo)志物分別在雷公藤配伍甘草組和雷公藤組含量變化呈現(xiàn)出反向的趨勢(shì);10個(gè)生物標(biāo)志物分別在雷公藤配伍甘草組和雷公藤組中則呈現(xiàn)出相同的含量變化趨勢(shì)，但程度均各異。在微觀水平上我們可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甘草發(fā)揮調(diào)和雷公藤肝毒性的同時(shí)，其體內(nèi)對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性小分子代謝物也發(fā)生著一定的改變，大多數(shù)均表現(xiàn)出與毒性作用相反的含量調(diào)整或在某種程度上中和其改變的趨勢(shì)，進(jìn)而促使代謝物水平進(jìn)行有序的轉(zhuǎn)歸變化。

2.3 代謝通路及富集分析

將上述鑒定出來(lái)的14個(gè)生物標(biāo)志物相關(guān)信息導(dǎo)入至MetaboAnalyst代謝組學(xué)在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，查看代謝通路及富集分析的相關(guān)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)與雷公藤配伍甘草減毒過程相關(guān)的代謝通路有4個(gè)，分別為嘌呤代謝（Purine metabolism）、硒氨基酸代謝（Selenoamino acid metabolism）、磷脂代謝（Sphingolipid metabolism）和嘧啶代謝（Pyrimidine metabolism），如圖4A和表2所示。其中嘌呤代謝在雷公藤配伍甘草減毒的過程中-log（P）值最大，即相關(guān)性最強(qiáng);硒氨基酸代謝在雷公藤配伍甘草減毒的過程中Impact值最大，即顯著影響性最大。富集分析結(jié)果，如圖4B所示，嘌呤代謝和硒氨基酸代謝的顯著相關(guān)性最強(qiáng)，其次為嘧啶代謝。

3 討論

病理組織形態(tài)學(xué)檢查HE染色結(jié)果顯示，雷公藤組大鼠的肝臟組織損傷明顯，而雷公藤配伍甘草組大鼠的肝組織則未見明顯的損傷;再者，相關(guān)生化指標(biāo)（AST、ALT、CRE、UREA、ALB）和炎性反應(yīng)遞質(zhì)（IL-1β、IL-6、TNF-α）結(jié)果數(shù)據(jù)也提示雷公藤配伍甘草后可有效降低其肝毒性。因此，我們認(rèn)為雷公藤配伍甘草可對(duì)肝臟起到一定的減毒保護(hù)作用[11]。

前期研究結(jié)果證實(shí)了甘草配伍雷公藤后可以有效地降低雷公藤的肝毒性反應(yīng)，具體地體現(xiàn)為肝臟病理組織、肝功生化指標(biāo)和炎性反應(yīng)遞質(zhì)的水平改善等[11-14]。而且，我們通過研究大鼠血清代謝組學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)了甘草配伍雷公藤后可以具體地作用于甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞油酸代謝等生物代謝通路。同樣地，我們?cè)谏鲜鲅芯炕A(chǔ)上，專門針對(duì)于甘草配伍雷公藤減毒大鼠尿液代謝組學(xué)進(jìn)行研究，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)減毒作用可能涉及到的其他未盡發(fā)現(xiàn)的生物代謝通路，以更好地詮釋體內(nèi)作用機(jī)制。

雷公藤配伍甘草的這一用藥組合來(lái)源于傳統(tǒng)中醫(yī)古方中的相關(guān)記載，也具有悠久的臨床使用經(jīng)驗(yàn)。本研究依據(jù)代謝組學(xué)的技術(shù)手段，比較了雷公藤組大鼠與雷公藤配伍甘草組大鼠以及空白對(duì)照組大鼠之間尿液樣本的微觀差異，結(jié)果顯示上述3組大鼠分別聚集在不同的象限區(qū)域內(nèi)，同時(shí)也體現(xiàn)出不同組別大鼠體內(nèi)的小分子代謝物水平相互之間存在著一定的差異性。再者，雷公藤配伍甘草組大鼠的分布區(qū)域介于雷公藤組和空白對(duì)照組之間。我們推測(cè)大鼠在受到雷公藤肝毒性的影響后，其體內(nèi)的小分子代謝物水平相比于正常大鼠出現(xiàn)了一定程度的偏離;而甘草通過發(fā)揮減毒功效后，這些發(fā)生異常改變的小分子代謝物則表現(xiàn)出了相應(yīng)的轉(zhuǎn)歸趨勢(shì)，即含量朝著正常的方向變化。

我們采用了多元統(tǒng)計(jì)方法PLS-DA來(lái)篩選這些具有顯著改變的小分子代謝物，并且通過HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)和metlin數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)這些代謝物的種類及性質(zhì)，進(jìn)而將其作為鑒定出的生物標(biāo)志物。本研究鑒定出14個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，其中涉及到胸苷酸激酶、脂肪酸、脂肪?；擒?、神經(jīng)氨酸、神經(jīng)酰胺、氨基酸、溶血卵磷脂、核糖核苷、鞘磷脂、肌酐三磷酸、白三烯、尿核苷、甲硫氨酸類物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝通路和硒氨基酸代謝通路的顯著影響性最高。我們認(rèn)為嘌呤代謝和硒氨基酸代謝與雷公藤肝毒性的發(fā)生密切相關(guān)，而甘草配伍后則可以通過調(diào)整這些代謝通路，促使其轉(zhuǎn)歸為正常狀態(tài)。其中，SAICAR（KEGG：C04823）和ITP（KEGG：C00081，Inosine triphosphate）作為嘌呤代謝通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn);Se-Adenosylselenomethionine（KEGG：C05691）作為硒氨基酸代謝通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，二者均發(fā)揮著不可或缺的作用。

雷公藤的毒性作用不僅體現(xiàn)在肝臟，在腎臟中也具有一定的毒性[15]。譬如本研究發(fā)現(xiàn)的嘌呤代謝和硒氨基酸代謝通路均與腎臟功能有著很大的聯(lián)系，一旦腎臟功能出現(xiàn)紊亂，那么與腎臟相關(guān)的代謝通路相應(yīng)也會(huì)發(fā)生一定程度的改變。中醫(yī)辨證論治中以甘草配伍雷公藤實(shí)現(xiàn)減毒，在緩解體內(nèi)臟器器官的毒性作用前提下，同步也改善著異常紊亂水平的代謝通路，實(shí)現(xiàn)表里合一的微宏觀作用。

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