史寶光,董蕾蕾,王奇,嚴辭

(1.沈陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院,沈陽 110002;2.杭州市第七人民醫(yī)院,杭州 310013)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一種進行性和不可逆性的神經退行性疾病,表現為記憶減退及認知功能障礙[1]。據報道,自 2010年以來全球約有3650萬AD患者,且每年新增病例約770萬人[2]。AD的發(fā)病機制目前尚未明了,可能與β淀粉樣蛋白沉積、Tau蛋白異常磷酸化、免疫炎癥和氧化應激等有關[3]。近年來研究表明,樹突萎縮和突觸丟失與認知功能損害有關。Cochran JN等[4]在2014年首次提出AD的突觸假說,認為AD患者存在神經軸突營養(yǎng)不良、樹突復雜性降低和樹突棘丟失。既往有研究顯示,可溶性 Aβ可導致海馬CA1區(qū)神經元樹突結構、棘突密度和突觸超微結構受損,導致AD早期認知功能障礙[5]。AD目前仍缺乏有效治療手段,針灸可能為AD的治療帶來新的思路。本課題組在前期研究發(fā)現,電針百會、腎俞和太溪穴可以改善 SAMP8小鼠的認知功能,并抑制大腦額葉Aβ蛋白和胰島素降解酶的表達[6]。為了進一步探討電針在 AD治療中的機制,本研究觀察電針治療后SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞樹突的結構變化,并檢測了突觸可塑性相關蛋白的表達,現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

16只7月齡SPF級SAMP8雄性小鼠和8只7月齡SPF級雄性正常老化SAMR1小鼠,體質量(25±5)g,均購于北京華阜生物科技有限公司(合同編號FKWDXs- 201600361)。動物在溫度為20℃～25℃、濕度為(50±5)%、明暗周期為12 h/12 h的環(huán)境中飼養(yǎng),允許自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠腦立體定位儀(89-00136,泰盟科技有限公司);電針治療儀(G6805,上海醫(yī)療器械有限公司生產);針灸針(0.30 mm×25 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(泰盟科技有限公司);振動切片機(KD-400,南北儀器設備有限公司);光學顯微鏡(CX31,奧林巴斯);戊巴比妥鈉[F20120816,中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司];Golgi-Cox溶液(HTKNS1125NH,博蕾德生物科技有限公司);BCA試劑盒(SJH1001,睿信生物科技有限公司);兔抗PSD-95(GR208408-1,Abcam公司);兔抗BDNF(ab108383,Abcam公司);兔抗p-TrkB和兔抗TrkB(P106674、P62539,Bioworld公司);兔抗RhoA(015H1492,Invitrogen公司);兔抗ROCK2(BS3482,Bioworld公司);β-actin抗體(130592-20,信裕生物科技有限公司)。

1.3 分組及干預方法

采用隨機數字表法將16只SAMP8雄性小鼠隨機分為模型組和治療組,每組 8只,另外 8只正常老化SAMR1小鼠作為對照組。對照組和模型組不做任何處理,治療組小鼠接受為期8周的電針干預。參考《實驗針灸學》[7]選取穴位,取百會(頂骨正中)、腎俞(第二腰椎下旁開5 mm之兩旁肋間)、太溪穴(內踝后方的凹陷部位)作為針刺點。電針治療儀治療頻率為2 Hz,電壓2 V,電流0.6 mA,1次/d,15 min/次,連續(xù)治療8周。

1.4 檢測指標

1.4.1 小鼠認知功能

療程結束后采用 Morris水迷宮實驗檢測所有小鼠的空間學習記憶能力。先定位導航實驗,將小鼠放入水中自由游泳2 min,以適應環(huán)境。定位航行實驗為期5 d,每天固定時間訓練4次。訓練開始時將平臺置于其中1個象限,每個時間段將小鼠從水池壁4個起始點面向水池壁放入水池。記錄小鼠每次2 min內尋找到平臺的時間,即為逃避潛伏期(如果2 min內小鼠未尋找到平臺,其潛伏期記錄為2 min)。每天以4次潛伏期的平均值為小鼠當日學習成績。空間探索實驗,定位導航實驗5 d后,于第6天撤除平臺進行空間探索實驗,將小鼠從某一固定象限放入水中,記錄2 min內跨平臺次數[8]。

1.4.2 小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞樹突超微結構

用 2%戊巴比妥鈉(10 mL/kg)麻醉小鼠,開胸后經主動脈灌注生理鹽水清洗小鼠體內血液,隨后用 4%多聚甲醛溶液進行灌注。取小鼠完整腦組織,浸泡于Golgi-Cox溶液中,避光室溫下放置2周。用切片機經海馬區(qū)冠狀連續(xù)切片(厚度為100 μm)。將切片浸泡于Golgi-Cox溶液中,隨后用ddH2O漂洗。用梯度乙醇依次脫水,二甲苯透化,用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元圖像。神經元圖像的選擇標準為錐體神經元位于 CA1區(qū)內,細胞位置和整體形態(tài)清晰,胞體和分支顏色均勻一致,第三分支完整。用Image J軟件對神經元進行重構并進行Sholl分析。以神經元胞體為中心,做間距為 20 μm的同心圓,分析樹突與同心圓的交點數之和,以此反映樹突分支[9]。

1.4.3 PSD95、BDNF、TrkB、RhoA和ROCK2蛋白表達檢測

用 Western blot法檢測突觸后致密蛋白(Postsynaptic density protein 95, PSD95)、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、酪氨酸激酶受體B(Tyrosine kinase receptor B, TrkB)、Ras同系物家族成員 A(Ras homolog family member A, RhoA)和Rho關聯卷曲螺旋蛋白激酶 2(rhoassociated coiled-coil containing protein kinase 2, ROCK2)蛋白表達。取小鼠海馬CA1組織,加入蛋白裂解液,勻漿后4℃離心。用BCA試劑盒進行蛋白定量檢測,隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳,將分離的蛋白電轉至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉,加入一抗。兔抗 PSD-95(1:1000)、兔抗BDNF(1:400)、兔抗p-TrkB和兔抗TrkB(1:500)、兔抗 RhoA(1:800)、兔抗 ROCK2(1:800)、β-actin內參抗體(1:1000),4℃搖床過夜。TBST洗滌3次后加入羊抗兔二抗,溫室下作用1 h,再用TBST洗滌3次,最后用ECL顯影。應用Image J軟件對結果進行圖像分析,計算條帶與β-actin的灰度比值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行數據處理分析。符合正態(tài)分布的數據用均數±標準差表示,組間比較用單因素方差分析,兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠認知功能

3組水迷宮訓練第5天時逃避潛伏期和跨平臺次數的組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=42.401,P＜0.001;F=7.128,P=0.004)。兩兩比較結果顯示,與對照組比較,模型組逃避潛伏期明顯延長(P＜0.001),而跨平臺次數明顯減少(P＜0.05);與模型組比較,治療組逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05),而跨平臺次數明顯增加(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 8周后3組小鼠逃避潛伏期和跨平臺次數比較

2.2 海馬CA1區(qū)錐體細胞樹突的超微結構

采用 Golgi染色法觀察海馬 CA1區(qū)錐體細胞樹突。3組基底和頂端樹突長度及分支數目的組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=29.996,P＜0.001;F=14.799,P＜0.001;F=7.684,P=0.003;F=16.382,P＜0.001)。與對照組比較,模型組基底和頂端樹突長度及分支數目明顯減少(均P＜0.001);與模型組比較,治療組基底和頂端樹突長度及分支數目均明顯增加(P＜0.001,P=0.001,P=0.005,P=0.028)。詳見圖2、圖3。

圖2 3組小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元的形態(tài)(Golgi染色,×200)

圖3 3組小鼠海馬CA1區(qū)神經元基底樹突和頂端樹突長度和分支數目比較

2.3 PSD95、BDNF、TrkB、RhoA和ROCK2蛋白表達水平

與對照組比較,模型組PSD95、BDNF和TrkB蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05),而RhoA和ROCK2表達水平明顯升高(P＜0.05)。電針治療8周后,與模型組比較,治療組PSD95、BDNF和TrkB蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05),而 RhoA和 ROCK2表達水平明顯下降(P＜0.05)。詳見圖4、圖5。

3 討論

阿爾茨海默病(AD)是一個全球性健康問題,給家庭和社會帶來沉重的負擔。針灸療法在AD治療中的作用越來越受到關注[10]。本研究用SAMP8快速老化小鼠進行研究,這種小鼠是從普通的遺傳群 AKR/J系小鼠中通過表型選擇培育出的快速老化小鼠,表現為早期增齡性學習記憶缺陷,同時伴有 Aβ淀粉樣蛋白沉積,是目前公認的用于研究AD的動物模型[11]。本研究發(fā)現,電針百會、腎俞、太溪穴,可以明顯改善SAMP8快速老化小鼠的空間學習記憶能力,并增加海馬 CA1區(qū)基底和頂端樹突長度和分支數目。

中醫(yī)學有記載稱“腦為髓之?！币约啊澳I藏精、主骨生髓”,腦髓的產生及代謝依賴于腎氣的不斷滋養(yǎng),故“腎腦相濟”理論是AD發(fā)病的主要病理機制[12-13]。本研究采用的百會穴隸屬于督脈,是足太陽膀胱經、手少陽三焦經、足少陽膽經、足厥陰肝經交匯之處,又稱三陽五會,為聯系腦部以及調節(jié)大腦功能的重要穴位[14]。腎俞穴隸屬于足太陽膀胱經,主要治療腰膝酸軟、泌尿系統(tǒng)感染等。太溪穴是足少陰原穴,臨床主治腎病、四肢厥冷,有滋陰益腎之功效。本課題組前期研究發(fā)現,電針百會、腎俞和太溪穴可以明顯縮短SAMP8小鼠逃避潛伏期[4],與本研究結果一致,說明電針可以改善老年癡呆小鼠的認知功能。

圖4 PSD95、BDNF和TrkB蛋白表達水平

圖5 RhoA和ROCK2蛋白表達水平

樹突是神經元胞體上伸出的短而多分支的突起,樹突的分支上有樹突棘,與其他神經元末梢形成突觸。樹突的形態(tài)決定了神經元的輸入及處理,進而影響突觸后輸出的能力。樹突在記憶和認知中有重要作用[15]。有研究發(fā)現,海馬 CA1區(qū)神經元錐體細胞的功能改變與認知功能障礙密切相關[16]。本研究發(fā)現,SAMP8小鼠海馬 CA1區(qū)錐體樹突的長度和分支數均發(fā)生變化,與?i?ková Z 等[17]和 Wang S 等[18]報道一致。Price 等用腹腔注射可溶性淀粉樣蛋白β低聚物建立了AD小鼠模型,發(fā)現海馬 CA1區(qū)頂端樹突的長度和分支數降低,而基底樹突未見明顯變化,這與本研究結果有所差異,可能與小鼠品系有關。本研究發(fā)現,電針8周后,SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)基底和頂端樹突長度和分支數目均明顯增加,進一步證實了電針對認知功能的作用。

PSD95是突觸后結構中的一種支架蛋白,對維持突觸結構和可塑性非常重要,能夠影響樹突的形態(tài)和數量[19]。BDNF是神經營養(yǎng)素家族的重要成員,對調控神經分化和生長非常重要。BDNF可結合細胞表面TrkB受體,進而激活下游信號通路。BDNF/TrkB可參與活性依賴的突觸可塑性調節(jié),能夠影響皮層和海馬的樹突數量和密度[20]。本研究發(fā)現,與正常老化小鼠比較,SAMP8快速老化小鼠海馬PSD95、BDNF和TrkB蛋白表達水平明顯下降。Li Y等[21]建立了Aβ25-35誘導的癡呆大鼠模型,發(fā)現海馬BDNF蛋白表達水平明顯下降,與本研究結果一致。Rho蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員,在大腦神經元樹突形態(tài)和突觸可塑性中具有重要作用。β-淀粉樣蛋白可以增加海馬 RhoA水平,抑制神經突起生長;激活 RhoA可降低樹突棘長度和密度[22]。既往研究證實,RhoA/ROCK2信號通路的激活與認知功能障礙有關[23]。本研究發(fā)現,SAMP8小鼠海馬RhoA和ROCK2明顯升高;經過8周的電針治療后,小鼠海馬PSD95、BDNF和TrkB蛋白表達水平明顯升高,而RhoA和ROCK2表達水平明顯下降。

綜上所述,電針可以明顯改善 SAMP8小鼠的認知功能,并增加海馬 CA1區(qū)基底和頂端樹突長度和分支數目。電針治療后海馬PSD95、BDNF和TrkB蛋白表達水平明顯升高,而RhoA和ROCK2表達水平明顯下降。上述結果提示,樹突可能是電針治療AD的靶點。未來需要進一步探討電針治療 AD的明確機制及持續(xù)作用時間。