鄭旋 康超 楊玲

摘 ? 要：為探索松乳菇分離培養(yǎng)條件，通過不同部位組織分離法對不同培養(yǎng)基進行松乳菇分離培養(yǎng)，分析了松乳菇菌柄、菌肉、菌柄與菌肉交界處組織分離的菌絲萌發(fā)和污染情況，以及4種培養(yǎng)基對松乳菇菌絲生長的影響。結(jié)果表明，從松乳菇菌柄與菌肉交界處進行組織分離的菌絲萌發(fā)率大、污染率小、分離成功率高;松乳菇菌絲在酵母葡萄糖培養(yǎng)基上生長速率快、長勢好，在PDA中添加干松針浸出液有利于松乳菇菌絲的培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：松乳菇;菌絲培養(yǎng);組織分離法;培養(yǎng)基

松乳菇（Lactarius deliciosus），隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、蘑菇目（Agaricales）、紅菇科（Russulaceae）、乳菇屬（Lactarius），別名松樹菌、松菌、紫花菌、美味松乳菇，是一種外生菌根真菌，其味道鮮美，具有較高的營養(yǎng)價值和生態(tài)價值，是兼具食藥用價值的珍貴食用菌，深受國內(nèi)外市場歡迎[1-2]。因松乳菇菌絲生長緩慢，需與宿主植物建立共生關(guān)系，且在適宜的生態(tài)條件下才能產(chǎn)生子實體，所以難以進行人工栽培[3]。目前，在新西蘭等國進行了松乳菇仿野生人工栽培并獲得成功[4-5]，但國內(nèi)鮮見相關(guān)報道，且松乳菇菌種分離培養(yǎng)難度大，不同的分離培養(yǎng)條件對松乳菇菌絲生長有著較大的影響[6-8]。

本研究通過考察不同部位組織分離法和不同培養(yǎng)基對松乳菇菌絲培養(yǎng)的影響，為成功獲得松乳菇菌種及后續(xù)開展松乳菇仿人工栽培提供依據(jù)。

1 ? 材料與方法

松乳菇為采集自貴陽市高坡市場的野生松乳菇，子實體完整，無損傷。

1.1 ? 試劑

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O為分析純（AR）;酵母粉為生化試劑（BR）;馬鈴薯、鮮松針、干松針等為市場購買。

1.2 ? 培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH值自然;

（2）酵母葡萄糖培養(yǎng)基（JM）：酵母浸出粉5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O為0.5 g，KH2PO4為1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然;

（3）鮮松針PDA培養(yǎng)基（SXZ）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，鮮松針浸出液（鮮松針200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然;

（4）干松針PDA培養(yǎng)基（SXG）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，干松針浸出液（干松針200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? 不同部位組織分離

挑選2個新鮮的野生松乳菇子實體，用軟刷去除表面雜質(zhì)，再用75%酒精擦拭表面1～2次。在超凈工作臺上，用手將消毒處理過的松乳菇子實體從中間一分為二掰開，盡量不要觸碰到子實體內(nèi)部，然后用經(jīng)過滅菌處理的解剖刀分別從菌柄、菌柄與菌肉交界處、菌肉3個部位，切取2～3 mm大小的組織塊放入PDA平板培養(yǎng)基上，每個處理3個重復(fù)，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)，記錄不同部位組織分離的菌絲萌發(fā)、污染等情況。

萌發(fā)率=萌發(fā)數(shù)量/分離總數(shù)×100%;污染率=污染數(shù)量/分離總數(shù)×100%;成功率=成功數(shù)量/分離總數(shù)×100%。

1.3.2 ? 菌種保存與活化

待菌絲萌發(fā)后，選取無污染、長勢好的菌絲再次轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲接近長滿平板表面時轉(zhuǎn)入PDA斜面試管中，于4 ℃溫度條件的冰箱內(nèi)保存。將保存的松乳菇菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基，活化10～20 d備用。

1.3.3 ? 不同培養(yǎng)基接種

分別將酵母葡萄糖培養(yǎng)基、鮮松針PDA培養(yǎng)基和干松針PDA培養(yǎng)基制作成平板（D=9 cm）培養(yǎng)基，挑取1塊活化的松乳菇菌塊（0.3 cm2）接種到培養(yǎng)基中央，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作為對照組，每個處理5個重復(fù)，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)35 d，觀察并測定松乳菇菌落形態(tài)、菌絲長勢、顏色、生長速率等。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 不同部位組織分離法對松乳菇分離的影響

采用組織分離法對松乳菇的不同部位進行分離試驗，結(jié)果如表1所示。由表1可見，松乳菇子實體不同部位組織分離的污染率由大至小分別為：菌柄>菌肉>菌柄與菌肉交界處;從萌發(fā)情況來看，菌柄與菌肉交界處萌發(fā)數(shù)量較多，自菌肉和菌柄部位分離的部位萌發(fā)率較低;分離成功率最高的為菌柄與菌肉交界處，成功率最低的為菌柄處。

2.2 ? 不同培養(yǎng)基對松乳菇菌絲培養(yǎng)的影響

2.2.1 ? 菌絲和菌落特征

由圖1可見，在不同的培養(yǎng)基上松乳菇的菌絲和菌落形態(tài)有較大差異。在SXG和PDA培養(yǎng)基上，菌落呈棕黃色，隨著培養(yǎng)時間延長，顏色不斷加深，部分有縱向鉤紋形成，菌絲粗壯，呈針尖狀，平匍或稍向空中延生生長;在SXZ培養(yǎng)基上，菌塊周圍有暗色色素沉淀的暈圈，菌落棕黃偏橘色，菌絲較細短，呈茸毛狀，部分產(chǎn)生溶解性菌液;在JM培養(yǎng)基上，菌落初期白色，后呈淡黃色，菌絲細密，匍匐貼壁生長。

2.2.2 ? 菌絲生長速度

由表2可以得知，隨著培養(yǎng)時間的增加，4種培養(yǎng)基上松乳菇菌絲開始萌發(fā)、生長，在20～25 d前菌絲生長較快、菌落直徑不斷增大;25～30 d后菌絲生長變緩慢、菌落直徑增幅變化不大。其中，菌絲在JM培養(yǎng)基上生長速度最快，菌落直徑最大，在第35天時菌落直徑達到最大值31.90 mm;其次是在SXG和PDA培養(yǎng)基上，第30天時菌落直徑分別達到8.41 mm和6.53 mm;而在SXZ培養(yǎng)基上，第25天時菌落直徑只有4.96 mm，之后菌絲停止生長。

3 ? 討論

通過比較不同部位組織分離法和不同培養(yǎng)基對松乳菇分離及菌絲培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，在進行松乳菇組織分離時，選取松乳菇菌柄和菌肉交界處的組織塊更有利于菌種分離成功;選擇以酵母浸出粉作為氮源的JM培養(yǎng)基有利于松乳菇菌絲快速生長;在PDA中添加干松針浸出液有利于菌絲形成;但在PDA中添加鮮松針浸出液則不利于菌絲生長，甚至?xí)a(chǎn)生抑制作用。

參考文獻：

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[ 2 ] 敖常偉，惠明，李忠海，等.松乳菇營養(yǎng)成分分析及松乳菇多糖的提取分離[J].食品工業(yè)科技，2003，24（9）：77-79.

[ 3 ] 欒慶書，王琴，趙瑞興，等.外生菌根真菌研究法（第1版）[M].沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

[ 4 ] Alexis Guerin-Laguette，Nicholas Cummings，Ruth CatherineButler，et al.Lactarius deliciosus and Pinus radiata in NewZealand： towards the development of innovative gourmetmushroom orchards[J].Mycorrhiza，2014，24（7）： 511-523.

[ 5 ] Guerin-Laguette A，Plassard C，Mousain D.Effects of experi-mental conditions on mycorrhizal relationships betweenPinus sylvestris and Lactarius deliciosus and unprecedentedfruit-body formation of the Saffron milk cap under controlledconditions[J].Canandian Journal of Microbiology，2000，46（9）：790-799.

[ 6 ] 羅振敏.野生松乳菇菌絲在不同培養(yǎng)基上的分離試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（3）：146.

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