陸 瑤， 趙 博， 武正華

(上海交通大學(xué) 藥學(xué)院， 上海 200240)

泛素是一種由76個(gè)氨基酸組成的分子量約為8.5 ku的蛋白質(zhì)。泛素(Ub)與泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)和底物蛋白一起構(gòu)成了泛素化途徑，作為一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程(Post-translational modification, PTM)[1]，在體內(nèi)參與了蛋白降解、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)及免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列重要生命活動(dòng)[2-3]。

泛素連接酶E3是泛素化體系中數(shù)量最多、調(diào)控機(jī)制最復(fù)雜的酶，也是泛素化體系中直接負(fù)責(zé)底物識(shí)別的部分。E3種類(lèi)繁多，但是它們都含有能與E2結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域。根據(jù)E3結(jié)構(gòu)域的不同，E3可被分為HECT家族(Homologous to E6-associated protein C-terminus)、RING-Finger家族(Really interesting new gene)和RBR家族(RING-in-between-RING)[4]。在RING家族中，某些E3具有一種約70個(gè)氨基酸組成的特征性U-box結(jié)構(gòu)域[5]，因此它們也屬于U-box家族成員。UBE4B(簡(jiǎn)稱(chēng)E4B)隸屬于U-box家族泛素連接酶，大小約為146 ku。

隨著近年來(lái)泛素領(lǐng)域研究的愈發(fā)深入，UBE4B作為一種重要的泛素連接酶，參與了胚胎發(fā)育、神經(jīng)元保護(hù)等生命活動(dòng)，并被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-7]。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了UBE4B的研究意義，本文從UBE4B的結(jié)構(gòu)特征、E4活性、特異性底物功能以及其在多種疾病中的重要作用進(jìn)行綜述，討論了UBE4B對(duì)于特異性底物蛋白進(jìn)行泛素化后可能具有的生理功能和對(duì)機(jī)體造成的影響。

1 UBE4B的來(lái)源與發(fā)現(xiàn)

從UBE4B的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已經(jīng)過(guò)去了20余年，最初Johnson等[8]通過(guò)分析泛素-β-半乳糖苷酶融合構(gòu)建物的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)了一條泛素融合降解途徑(Ubiquitin fusion degradation, UFD)，并確定了該途徑涉及的5個(gè)基因，分別是Ufd1-Ufd5。Koegl等[9]基于樹(shù)脂親和洗脫和質(zhì)譜分析，從釀酒酵母中分離鑒定了UFD2，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以作為E4因子促進(jìn)泛素鏈的延長(zhǎng)。UBE4B(也稱(chēng)UFD2a)是UFD2的哺乳動(dòng)物同源物，因E4活性得名UBE4B[10]。隨后Hatakeyama等[11]提出，UBE4B作為U-box家族成員，是一種新型的E3，且在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守。UBE4B已被確認(rèn)參與p53、EGFR等重要蛋白的降解，目前是泛素領(lǐng)域研究的熱門(mén)泛素連接酶。

2 UBE4B的結(jié)構(gòu)特征與生物學(xué)功能

2.1 U-box家族E3 UBE4B

UBE4B具有特征性的U-box結(jié)構(gòu)域，刪除U-box結(jié)構(gòu)域或者對(duì)其中的保守氨基酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變，則E3酶活性喪失，說(shuō)明了U-box家族E3的酶活性是由完整的U-box結(jié)構(gòu)域決定的[11]。通過(guò)序列與結(jié)構(gòu)對(duì)比(圖1)，U-box與RING結(jié)構(gòu)的保守序列中有著相似的3條鏈、一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)和一個(gè)特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但是U-box結(jié)構(gòu)域缺乏RING-鋅指結(jié)構(gòu)中螯合的鋅離子和標(biāo)志性的半胱氨酸與組氨酸殘基[12]。U-box與RING結(jié)構(gòu)的相似性關(guān)聯(lián)了二者傳遞Ub功能的相似性，成為將U-box E3劃分為RING家族的有力證據(jù)。

2.2 UBE4B的E3與E4活性

E3催化底物形成泛素鏈對(duì)于蛋白質(zhì)降解過(guò)程至關(guān)重要，但是在完成泛素化之前底物脫離E3，形成的泛素標(biāo)簽容易脫去，底物也將逃過(guò)被泛素化的命運(yùn)[13]。UBE4B作為一類(lèi)U-box型E3，可以與E1、E2一起進(jìn)行泛素級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將Ub傳遞對(duì)應(yīng)的底物蛋白上，完成泛素化過(guò)程。UBE4B還可作為特殊的泛素連接E4[9]：一種在E1、E2、E3已經(jīng)完成底物的泛素化標(biāo)記后，繼續(xù)延長(zhǎng)底物泛素鏈的泛素連接酶。如圖2所示，在缺乏UBE4B時(shí)，雖然某些E1-E2-E3體系可以在對(duì)應(yīng)底物上傳遞少量泛素，但是并不能夠形成足夠長(zhǎng)的泛素鏈以啟動(dòng)蛋白酶體降解，UBE4B可以識(shí)別底物的K29泛素鏈，繼續(xù)幫助泛素鏈延伸[9]。E4與E3的區(qū)別在于：E4不參與硫酯鍵形成，且不與底物相互作用[9]。目前有幾種可能的機(jī)制解釋E4介導(dǎo)的多聚泛素化過(guò)程：1)E4改變E2與E3的作用模式或改變E2-E3復(fù)合物的構(gòu)象，改變E2或者HECT E3的泛素結(jié)合活性位點(diǎn)，以限制泛素從E2或者HECT E3轉(zhuǎn)移到底物；2)E4可能作為泛素連接持續(xù)促進(jìn)因子，提高泛素鏈的延長(zhǎng)效率[14]。雖然對(duì)于UBE4B可作為E4參與泛素鏈延長(zhǎng)已有一定認(rèn)識(shí)，但是目前的研究方法還不能直接區(qū)分UBE4B在特定底物泛素化中扮演的角色，如何分辨E3與E4還需要進(jìn)一步探明。

3 UBE4B的底物

UBE4B可以作為E3或者E4與底物蛋白相互作用，已有許多針對(duì)其底物功能的研究，包括p53家族蛋白[15, 28-29]、ataxin-3[16]、FEZ1蛋白[17]、激酶Mps1[24]和EGFR[18, 23]等。這些底物蛋白大部分參與機(jī)體的重要生命活動(dòng)，或與疾病發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。

圖1 RING結(jié)構(gòu)域 (A)與U-box結(jié)構(gòu)域(B)[12]

圖2 UBE4B作為E4延伸泛素鏈

研究發(fā)現(xiàn)，UBE4B的過(guò)表達(dá)極大程度降低了各種類(lèi)型細(xì)胞中p53蛋白的含量[15]。抑癌蛋白p53是泛素連接酶Mdm2的底物，Mdm2的人類(lèi)同源物也叫作Hdm2，可以靶向作用于Ser-15和Ser-392位絲氨酸磷酸化的p53，使其快速降解[19-20]。在幾種腦部腫瘤和神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞系中觀察到UBE4B蛋白表達(dá)量升高，且在這些腫瘤細(xì)胞系中，UBE4B的表達(dá)與p53的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，UBE4B可能作為E4，參與了Hdm2介導(dǎo)的p53泛素化和降解[15]。MicroRNA-1301可以直接靶向作用UBE4B，顯著下調(diào)該基因表達(dá)，降低內(nèi)生UBE4B蛋白以激活p53功能[21]。除p53之外，p53家族的其他兩個(gè)成員p63[5]和p73[22]也可以與UBE4B相互作用。Ataxin-3是一種與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的去泛素化酶(Deubiquitinase，DUB)，能夠被泛素化降解。細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的UBE4B可以促進(jìn)異常聚積的ataxin-3降解，而UBE4B的失活突變體則無(wú)法促進(jìn)異常蛋白降解；UBE4B無(wú)法在僅存在E1、E2的條件下使ataxin-3泛素化，暗示UBE4B在ataxin-3泛素化降解途徑中可能作為E4發(fā)揮作用[16]。FEZ1是一種與神經(jīng)突觸延伸相關(guān)的蛋白，UBE4B可以發(fā)揮E3活性，在FEZ1上形成K27泛素鏈，且這一泛素化過(guò)程不會(huì)降解底物[17]。UBE4B可以有效降解EGFR，通過(guò)調(diào)控EGFR泛素化來(lái)促進(jìn)其在胞內(nèi)的分選和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18, 23]。激酶Mps1參與了紡錘體形成、染色體復(fù)制，UBE4B可以調(diào)控激酶Mps1的泛素化，形成K48泛素鏈[24]。上述蛋白雖已被證明是UBE4B的底物，但是形成的泛素鏈類(lèi)型與功能還值得進(jìn)一步研究。

探究E3特異性底物及其生理功能是泛素領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，但泛素化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，不同底物形成的泛素鏈類(lèi)型和功能不同，明確UBE4B的對(duì)應(yīng)底物、解密形成的泛素鏈種類(lèi)有助于確定藥物作用靶點(diǎn)，針對(duì)性治療相關(guān)疾病[25]。在已鑒定的部分UBE4B底物中(表1)，研究者采用酵母雙雜交系統(tǒng)[15, 17, 23, 26]或從組織樣本中進(jìn)行基因分析[24, 27]尋找與UBE4B相互作用的蛋白，但是這些方法特異性較低且耗時(shí)耗力，可能存在假陽(yáng)性結(jié)果，需要經(jīng)過(guò)多重手段驗(yàn)證，無(wú)法大批量直接篩選UBE4B潛在底物。正交泛素轉(zhuǎn)移途徑(Orthogonal ubiquitin transfer, OUT)利用噬菌體展示技術(shù)，定點(diǎn)突變Ub、E1、E2和E3，構(gòu)建一條體內(nèi)正交泛素傳遞鏈，將人工改造后帶有標(biāo)簽的Ub模擬天然泛素傳遞過(guò)程，尋找攜帶標(biāo)記Ub的蛋白，可以準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)某種E3的大量底物[28-30]。通過(guò)這種方法，我們已經(jīng)確定了180余種UBE4B潛在底物，且部分底物已在胞內(nèi)驗(yàn)證(表1)[29]，未來(lái)還將對(duì)重要底物的生理功能進(jìn)行進(jìn)一步探索。

表1 UBE4B底物的生理作用和相關(guān)疾病

4 UBE4B與相關(guān)疾病

UBE4B在泛素化途徑中扮演著重要的角色，參與了多種蛋白的降解。泛素化系統(tǒng)異常導(dǎo)致的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤聚積或提前降解與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此UBE4B在體內(nèi)的表達(dá)異?？赡芘c多種疾病或病理狀態(tài)有關(guān)。

4.1 UBE4B影響癌癥發(fā)生發(fā)展

UBE4B可作為癌基因或者抑癌基因在不同類(lèi)型的癌癥中發(fā)揮相反的功能。在人類(lèi)肝癌細(xì)胞系中敲除UBE4B可以減緩肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡。通過(guò)對(duì)多個(gè)臨床樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，UBE4B的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了肝癌的發(fā)生發(fā)展和遷移侵襲[31]。不僅如此，目前還發(fā)現(xiàn)了UBE4B在乳腺癌[32]、鼻咽癌[27]、神經(jīng)管細(xì)胞瘤[15]以及人腎細(xì)胞癌[33]中，在癌細(xì)胞系SH‐SY5Y、SAOS‐2、H1299和Neuro2a中高度表達(dá)[31]。裸鼠模型中也發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)UBE4B的腫瘤細(xì)胞比正常表達(dá)UBE4B的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率更快[32]。UBE4B在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中則是作為抑癌基因存在的，UBE4B水平與RAS / MAPK途徑活性呈負(fù)相關(guān)，缺失UBE4B基因的神經(jīng)母細(xì)胞瘤不容易分化，其患者在臨床上表現(xiàn)出明顯的預(yù)后不良[7]。UBE4B的過(guò)表達(dá)可以降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖，減少腫瘤組織中EGFR的表達(dá)[18]。

4.2 UBE4B與神經(jīng)退行性疾病的聯(lián)系

UBE4B可以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，可能與某些神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，有望成為神經(jīng)退行性疾病的治療靶點(diǎn)。Ataxin-3異常聚積會(huì)引起遺傳性神經(jīng)退行性疾病Machado-Joseph癥，UBE4B與異常Ataxin-3蛋白的多聚泛素化有關(guān)[16]。小鼠Wallerian變性模型中發(fā)現(xiàn)UBE4B可以保護(hù)小鼠的神經(jīng)元，延遲Wallerian變性[5]?？傊?，目前研究表明UBE4B對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)具有一定保護(hù)作用，但是具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4.3 UBE4B與其他疾病

在UBE4B轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠模型中，研究者發(fā)現(xiàn)UBE4B的增加可能導(dǎo)致下丘腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白的異常積累、神經(jīng)元變性和功能損傷，從而導(dǎo)致食物攝入和能量代謝紊亂。下丘腦飽腹感中樞的功能障礙會(huì)引起UBE4B轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型肥胖，發(fā)生瘦素和胰島素抵抗，葡萄糖耐受不良，高膽固醇血癥等癥狀[34]。UBE4B在胚胎發(fā)育過(guò)程中可以保持心臟正常發(fā)育和保護(hù)神經(jīng)元免于軸突變性[35]。敲除UBE4B基因的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)軸突發(fā)育障礙，同時(shí)伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的浦肯野細(xì)胞變性和心肌細(xì)胞凋亡，表明UBE4B可以維持神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)環(huán)境并保護(hù)它們免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和其他類(lèi)型的細(xì)胞應(yīng)激的影響，保護(hù)胚胎正常發(fā)育[35]。在人類(lèi)細(xì)胞中，UBE4B基因敲減會(huì)導(dǎo)致有絲分裂停滯、染色體異常及細(xì)胞凋亡，證明UBE4B對(duì)于人類(lèi)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)十分必要[6]。

5 結(jié)語(yǔ)

UBE4B是U-box家族兼具E4活性的泛素連接酶，可形成或延長(zhǎng)不同種類(lèi)的泛素鏈，決定底物的命運(yùn)，調(diào)控重要生命活動(dòng)進(jìn)程。但是UBE4B在不同類(lèi)型的疾病中扮演的角色良莠難辨，現(xiàn)有的研究仍存在不少亟待解決的問(wèn)題：在不同類(lèi)型腫瘤中，UBE4B的表達(dá)和對(duì)患者預(yù)后影響存在截然相反的情況，但是沒(méi)有研究明確指出造成這些差異的機(jī)制；UBE4B的下游底物相關(guān)信號(hào)通路和作用機(jī)制研究大多浮于表面，目前報(bào)道中僅有經(jīng)典抑癌蛋白p53的研究較為深入，其他的重要底物如EGFR、OTUB1等研究還不夠具體；UBE4B分布較廣，組織特異性較差，且針對(duì)不同底物蛋白調(diào)節(jié)作用各異，這給開(kāi)發(fā)藥物進(jìn)行特異性治療帶來(lái)了一定的困難。

相信隨著研究的逐步推進(jìn)，未來(lái)的研究重點(diǎn)將是UBE4B對(duì)應(yīng)的多種底物生理功能、形成泛素鏈類(lèi)型與調(diào)控的下游反應(yīng)。闡明底物蛋白在體內(nèi)的含量變化對(duì)正常生命活動(dòng)的影響，探索對(duì)應(yīng)疾病的發(fā)生機(jī)制和新穎治療手段，為針對(duì)UBE4B乃至E3藥物開(kāi)發(fā)提供一大優(yōu)勢(shì)。