張海麗， 徐品品， 劉數(shù)華， 冷立健， 周文廣

(1. 南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院 鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南昌 330031； 2. 武漢大學(xué) 水資源與水電工程科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430072)

傳統(tǒng)的建筑膠凝材料主要包括硅酸鹽水泥、石灰、石膏和水玻璃等[1]，其中硅酸鹽水泥是目前用量最大的一種建筑材料，但由于其能耗較高，生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，污染較為嚴(yán)重，且在生產(chǎn)運(yùn)輸過程中容易產(chǎn)生引起環(huán)境污染的不利性因素，對(duì)人類的生活與健康有較大的危害[2]。因此，國內(nèi)外許多學(xué)者嘗試尋找一種新型環(huán)保的膠凝材料。近年來，微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積(Microbial induced calcium carbonate precipitation，MICP)作為一種新型環(huán)保膠凝技術(shù)逐漸被大眾所熟知，微生物通過自身礦化作用誘導(dǎo)產(chǎn)生碳酸鈣沉淀并能有效地將散粒材料膠結(jié)成具有一定強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)完整性的整體[3-4]。該技術(shù)具有能耗低、環(huán)境友好、反應(yīng)過程簡單等特點(diǎn)，已在巖土工程和環(huán)境工程中具有廣泛的應(yīng)用[5-6]。

早在2004年，Whiffin[7]就利用從土壤中分離出的芽孢桿菌進(jìn)行微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積實(shí)驗(yàn)，與未進(jìn)行生物固結(jié)砂體相比，生物膠結(jié)砂體的強(qiáng)度和剛度分別提高了8倍和3倍，該實(shí)驗(yàn)研究使微生物水泥的運(yùn)用成為了可能。Sun等[8]研究了兩種芽孢桿菌在不同溫度條件下對(duì)微生物誘導(dǎo)碳酸鈣的影響，低溫條件下在培養(yǎng)基中添加尿素能提高鈣沉淀率，使后續(xù)的低溫誘導(dǎo)碳酸鈣沉積技術(shù)成為可能。Zhang等[9-10]研究了不同鈣源對(duì)MICP過程的影響，發(fā)現(xiàn)使用乙酸鈣誘導(dǎo)沉積得到的砂柱有較好的物理性能，同時(shí)乙酸鈣中的乙酸可以作為有機(jī)碳源為細(xì)菌提供營養(yǎng)物質(zhì)。Omoregie等[11]研究了pH值、溫度和尿素濃度對(duì)細(xì)菌脲酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在中溫、pH堿性值和高尿素濃度下能獲得高脲酶活性細(xì)菌。Dhami[12]和Al-salloum[13]等研究細(xì)菌種類、培養(yǎng)基種類和細(xì)菌濃度對(duì)生成的碳酸鈣含量及晶型有一定影響，從而得到具有不同抗壓強(qiáng)度的砂柱試樣。

綜上所述，盡管國內(nèi)外學(xué)者研究了溫度、鈣源、脲酶活性、微生物種類及濃度對(duì)微生物誘導(dǎo)沉積過程的影響，但是很少考慮膠結(jié)方式對(duì)微生物誘導(dǎo)沉積過程影響的研究。因此，考慮微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積的成型工藝對(duì)微生物水泥的現(xiàn)場規(guī)模生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。本文研究了不同膠結(jié)方式對(duì)MICP過程的影響，實(shí)驗(yàn)從砂柱溶液的出水流速、pH值、脲酶活性、剩余尿素含量、碳酸鈣含量和抗壓強(qiáng)度等參數(shù)指標(biāo)來表征膠結(jié)方式對(duì)誘導(dǎo)沉積過程的效果，為微生物水泥的生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌液的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)選用的菌種為巴氏芽孢桿菌(Sporosarcinapasteurii)，購于美國菌種保藏中心(ATCC 6453)，經(jīng)活化富集后再培養(yǎng)。為有利于菌種的新陳代謝和繁殖，確定本實(shí)驗(yàn)菌液的培養(yǎng)基成分及含量為：酵母膏20 g/L，硫酸銨10 g/L。并將培養(yǎng)基置于121 ℃狀態(tài)下滅菌20 min。細(xì)菌培養(yǎng)溫度穩(wěn)定為30 ℃，振蕩床轉(zhuǎn)速調(diào)至150 r/min，細(xì)菌振蕩培養(yǎng)24～36 h，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)到OD600為0.8～1.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 膠結(jié)溶液

為了提供微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積過程所需的鈣離子和尿素，需配制一定濃度的膠結(jié)液。本實(shí)驗(yàn)?zāi)z結(jié)溶液是由乙酸鈣和尿素按1∶1比例混合而成的溶液，乙酸鈣和尿素濃度分別為0.3 mol/L。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用砂

本實(shí)驗(yàn)所用砂為粒徑在0.15～0.3 mm的細(xì)粒砂，砂粒中二氧化硅含量為98%，經(jīng)篩分實(shí)驗(yàn)后，砂粒的顆粒級(jí)配曲線繪制如圖1所示。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)選用模具為50 mL的針筒，經(jīng)MICP實(shí)驗(yàn)?zāi)z結(jié)后所得砂柱直徑25 mm，高40 mm。將裝備好的砂柱用去離子水反復(fù)沖洗3次，以去除砂顆粒間的氣泡。

1.2.1 連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式

連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)采用流動(dòng)速度為1.0 mL/min的蠕動(dòng)泵將恒溫振蕩培養(yǎng)箱中20 mL菌液注入砂柱中，出水口用50 mL燒杯收集溶液，再將燒杯中溶液通過蠕動(dòng)泵不斷注入砂柱；12 h后將20 mL膠結(jié)液注入砂柱中，反應(yīng)時(shí)間為12 h；以此為一個(gè)連續(xù)運(yùn)行周期，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行14個(gè)周期。對(duì)照實(shí)驗(yàn)選用不添加菌液，以去離子水代替菌液進(jìn)行膠結(jié)，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行樣。

圖1 實(shí)驗(yàn)用砂級(jí)配曲線

1.2.2 間斷運(yùn)行膠結(jié)方式

間斷運(yùn)行膠結(jié)是將恒溫培養(yǎng)箱中20 mL菌液通過流動(dòng)速度為1.0 mL/min的蠕動(dòng)泵注入砂柱中，待菌液完全注入砂柱后將出水口封堵；12 h后，將菌液排出并注入20 mL膠結(jié)液于砂柱中，再將出水口封堵，反應(yīng)時(shí)間為12 h；以此為一個(gè)連續(xù)運(yùn)行周期，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14個(gè)周期。對(duì)照實(shí)驗(yàn)選用不添加菌液，以去離子水代替菌液進(jìn)行膠結(jié)，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同，每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行樣。

1.2.3 參數(shù)測定

收集砂柱中的流出液并測定其7個(gè)連續(xù)周期的pH值、電導(dǎo)率、脲酶活性、剩余尿素濃度和砂柱的出水流速。pH值是通過pH計(jì)測得。脲酶活性是通過測定1 mL菌液和9 mL 1.1 mol/L的尿素在5 min內(nèi)電導(dǎo)率的變化率，再乘以10的稀釋倍數(shù)所得到[7]。尿素濃度則是通過比色法來測定，將4 mL試樣與2 mL 4%的對(duì)二甲基苯氨基和4%的硫酸乙醇溶液混合均勻，顯色10 min后，在422 nm處測定其吸光度[14]。而通過收集流出砂柱的液體體積，再除以相應(yīng)的流出時(shí)間，以此來計(jì)算砂柱出水的流速[15]。

砂柱膠結(jié)完成后，用去離子水充分沖洗砂柱，而后將其放入恒溫干燥箱進(jìn)行烘干處理(烘烤溫度60 ℃，烘干時(shí)間為72 h)，待其脫模后，測定不同砂柱位置的碳酸鈣含量及砂柱抗壓強(qiáng)度，XRD和SEM。為定量獲取MICP實(shí)驗(yàn)生成的碳酸鈣質(zhì)量，對(duì)砂柱施加過量的鹽酸，經(jīng)1 h充分反應(yīng)后，用去離子水反復(fù)沖洗試樣3次，再置于恒溫干燥箱中經(jīng)105 ℃烘干，試樣酸洗前后的質(zhì)量差即為碳酸鈣含量。通過使用萬能拉力試驗(yàn)機(jī)(HD-B609B-S)對(duì)砂柱進(jìn)行抗壓強(qiáng)度測試，加載為1 mm/min。XRD是通過使用X射線衍射儀(Bruker D8 ADVANCE)測定。SEM是通過使用場發(fā)射掃描電鏡(JSM-6701F)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)細(xì)菌生長活性的影響

為獲得芽孢桿菌新陳代謝和繁殖的最佳pH值，以保證MICP膠結(jié)砂柱實(shí)驗(yàn)的有效進(jìn)行。在進(jìn)行膠結(jié)實(shí)驗(yàn)前，預(yù)先探討pH值對(duì)細(xì)菌生長活性的影響，實(shí)驗(yàn)分別繪制了pH值為7、8、9、10這4個(gè)不同pH值梯度的細(xì)菌生長曲線及其脲酶活性曲線。結(jié)果圖2和圖3表明：細(xì)菌在pH值為8時(shí)，細(xì)菌生長得到最大促進(jìn)，培養(yǎng)48 h后細(xì)菌濃度和脲酶活性達(dá)到最佳狀態(tài)，在pH值為10時(shí)，細(xì)菌生長受到顯著抑制。

圖 2 不同pH值細(xì)菌生長曲線

圖 3 不同pH值細(xì)菌脲酶活性

表1為細(xì)菌在不同pH值條件下達(dá)到的最大OD600和脲酶活性。當(dāng)pH值為8時(shí)，實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)菌生長處于最佳狀態(tài)，測得OD600最高可達(dá)0.946，脲酶活性可達(dá)602 us/(cm·min)；而當(dāng)pH值為10時(shí)，過高的堿性環(huán)境顯著的抑制了細(xì)菌生長，脲酶活性最大只有52 us/(cm·min)。因此，本實(shí)驗(yàn)芽孢桿菌適合在堿性環(huán)境生長，但當(dāng)細(xì)菌生長環(huán)境的pH值超過10時(shí)，其生長會(huì)受到顯著的抑制。

表 1 細(xì)菌在不同pH值條件下達(dá)到的最大OD600和脲酶活性

2.2 不同膠結(jié)方式對(duì)砂柱出水流速的影響

為了表征經(jīng)MICP試驗(yàn)后砂柱內(nèi)部孔隙的填充效果，實(shí)驗(yàn)分別測定了兩種膠結(jié)方式下7個(gè)連續(xù)周期時(shí)間砂柱的出水流速，圖4給出了連續(xù)運(yùn)行和間斷運(yùn)行兩種膠結(jié)方式下砂柱的出水流速隨實(shí)驗(yàn)周期的變化規(guī)律。砂柱的初始流速經(jīng)測定為46.15 mL/min，砂柱膠結(jié)一個(gè)周期后，連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)的砂柱出水流速變?yōu)榱?8.75 mL/min，流速降低了59.37%，而采用間斷運(yùn)行膠結(jié)的砂柱的出水流速為30.12 mL/min，流速降低了34.73%。在連續(xù)膠結(jié)7個(gè)周期后，連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)砂柱的出水流速降至0.12 mL/min，而間斷運(yùn)行膠結(jié)砂柱的出水流速降至0.74 mL/min。兩種膠結(jié)方式的砂柱出水流速都降低了98%以上，這也進(jìn)一步說明了微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀具有顯著的膠結(jié)作用并且可以有效封堵砂粒間的空隙，從而降低砂柱的孔隙率。另外由圖4可以清晰地看出，經(jīng)連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)下砂柱的出水速度小于同一時(shí)間下經(jīng)間斷運(yùn)行膠結(jié)下砂柱的出水速度，表明在連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式下的孔隙填充效果優(yōu)于經(jīng)間斷運(yùn)行膠結(jié)下的孔隙填充效果。主要是由于在連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式下增大了菌液、膠結(jié)液和砂粒之間的接觸面積，使得經(jīng)MICP試驗(yàn)后持續(xù)生成的碳酸鈣沉淀黏結(jié)在砂粒表面，從而減少了砂柱的孔隙率，降低了砂柱的出水流速。

圖 4 不同膠結(jié)方式砂柱的出水流速

2.3 不同膠結(jié)方式砂柱出水的pH值和脲酶活性變化

圖5和圖6分別給出了不同膠結(jié)方式下砂柱的出水pH值和脲酶活性隨實(shí)驗(yàn)周期的變化規(guī)律。由圖5可以看出，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，砂柱的出水pH值都在8.1～8.6范圍內(nèi)，而對(duì)照實(shí)驗(yàn)組工況下的砂柱pH值都維持在7.8～8.0范圍內(nèi)，明顯可以看出實(shí)驗(yàn)組工況下砂柱的出水pH值都大于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組工況下砂柱的出水pH值，這也進(jìn)一步說明了細(xì)菌在新陳代謝活動(dòng)過程中產(chǎn)生大量高活性脲酶將尿素水解成碳酸根離子和銨根離子，從而產(chǎn)生了堿性環(huán)境，使得砂柱的出水pH值逐漸升高[16]，而對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中未添加細(xì)菌，故溶液中不含有可以將尿素水解成碳酸根離子和銨根離子的高活性脲酶，因此環(huán)境pH未發(fā)生明顯變化。

由圖6可知，砂柱出水的脲酶活性隨著膠結(jié)周期數(shù)的增加而逐漸下降，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組砂柱未添加細(xì)菌，因此脲酶活性為零，圖中未給出對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的脲酶活性曲線。砂柱出水的脲酶活性逐漸降低，主要有兩個(gè)原因，其一是細(xì)菌作為成核位點(diǎn)，被形成的碳酸鈣沉淀包裹而死亡[17]，導(dǎo)致細(xì)菌濃度降低，脲酶活性也隨之降低。其二是在MICP過程中，砂柱孔隙減少，營養(yǎng)物質(zhì)不能運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌，使得細(xì)菌生長受到抑制，脲酶活性下降。而連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)的細(xì)菌脲酶活性高于間斷運(yùn)行膠結(jié)的細(xì)菌，表明連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式的細(xì)菌生長優(yōu)于間斷運(yùn)行膠結(jié)方式的細(xì)菌生長，最后由于砂柱孔隙逐漸減少，兩種膠結(jié)方式的細(xì)菌脲酶活性無顯著差別。

圖 5 不同膠結(jié)方式的砂柱出水pH值

圖 6 不同膠結(jié)方式砂柱出水的脲酶活性

2.4 不同膠結(jié)方式砂柱出水的剩余尿素濃度

圖7給出了不同膠結(jié)方式下砂柱出水剩余尿素濃度隨實(shí)驗(yàn)周期的變化規(guī)律。由圖7可知，在實(shí)驗(yàn)前期，砂柱出水的剩余尿素濃度較高，尿素利用率保持在58%范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5個(gè)膠結(jié)周期后，砂柱出水的剩余尿素濃度顯著降低，尿素的利用率在90%以上，隨著膠結(jié)周期數(shù)的增加，剩余尿素濃度也呈現(xiàn)增加的趨勢，主要是由于在砂柱膠結(jié)初期，砂顆粒間的孔隙較大，細(xì)菌細(xì)胞不易吸附在砂顆粒表面，MICP過程緩慢；隨著膠結(jié)周期數(shù)的增加，細(xì)菌細(xì)胞能大量吸附在砂顆粒孔隙之間，細(xì)菌細(xì)胞分泌的脲酶能迅速水解尿素，產(chǎn)生的碳酸根與鈣離子結(jié)合并生成碳酸鈣沉淀，導(dǎo)致砂柱孔隙率顯著降低，造成細(xì)菌生長環(huán)境變得惡劣并使得細(xì)菌活性降低，因此砂柱出水的剩余尿素濃度開始增加。由圖7可以清晰地看出經(jīng)連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)下砂柱出水的剩余尿素濃度小于同一時(shí)間下經(jīng)間斷運(yùn)行膠結(jié)下砂柱出水的剩余尿素濃度，主要是由于連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)砂柱中的膠結(jié)液能不斷在砂顆粒間連續(xù)運(yùn)行，從而使細(xì)菌水解尿素持續(xù)進(jìn)行，導(dǎo)致膠結(jié)液中尿素降低，尿素的利用率較高，而間斷運(yùn)行膠結(jié)砂柱中的膠結(jié)液未能持續(xù)與砂顆粒間的細(xì)菌接觸，從而使尿素利用率低，砂柱出水的剩余尿素濃度較高。

2.5 不同膠結(jié)方式的砂柱碳酸鈣含量及抗壓強(qiáng)度

連續(xù)運(yùn)行砂柱體和間斷運(yùn)行砂柱體不同部位的碳酸鈣含量變化規(guī)律結(jié)果(圖8)顯示，砂柱在的不同部位碳酸鈣含量存在明顯差異，其中上部的碳酸鈣含量最多，中部次之，下部最少。其中，兩種膠結(jié)方式得到的砂柱體的碳酸鈣含量在上部時(shí)無顯著差別，分別為28%和26%。但是，其下部的碳酸鈣含量差異比較明顯，連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)的砂柱下部的碳酸鈣含量比間斷運(yùn)行膠結(jié)砂柱下部的碳酸鈣含量高2倍多。圖 9為砂柱試樣的實(shí)物圖，a為連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)試樣，b為間斷運(yùn)行膠結(jié)試樣。連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)得到的砂柱抗壓強(qiáng)度可達(dá)6.32 kPa，間斷運(yùn)行膠結(jié)得到的砂柱的抗壓強(qiáng)度可達(dá)3.67 kPa。結(jié)合圖 8和圖 9，連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式下得到一個(gè)完整的砂柱，間斷運(yùn)行膠結(jié)方式下得到一個(gè)局部砂柱。兩種膠結(jié)方式得到的砂柱試樣差異明顯，主要由于間斷運(yùn)行膠結(jié)砂柱上部誘導(dǎo)沉積效果顯著，砂粒間的孔隙顯著降低，導(dǎo)致膠結(jié)液和菌液被截留在砂柱上表面，下部的砂柱不能有效地進(jìn)行MICP過程且生成的碳酸鈣含量較低。而連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)砂柱的膠結(jié)液和菌液都是貫通在整個(gè)砂柱中，使得整個(gè)試樣能有效進(jìn)行MICP過程。

圖 7 不同膠結(jié)方式的砂柱出水剩余尿素濃度

圖 8 不同部位砂柱的碳酸鈣含量

2.6 XRD和SEM分析

圖 10為砂柱的XRD圖譜，SiO2為砂的主要成分，方解石(CaCO3)為MICP過程的產(chǎn)物。圖 11為砂柱的SEM圖像，a為100倍電鏡下砂顆粒的圖，b為4000倍電鏡下砂顆粒的圖。在圖 11-a中，砂顆粒之間被緊緊膠結(jié)在一起，并堆積在砂粒間；圖11-b能看到砂表面包裹的方解石和桿狀細(xì)菌，還能看到碳酸鈣表面的小孔，這是細(xì)菌作為成核位點(diǎn)遺留下來的痕跡，它能作為黏結(jié)砂顆粒的橋梁并在誘導(dǎo)沉積中起著關(guān)鍵的作用[18]。結(jié)合圖 10和圖 11，表明砂柱是由方解石膠結(jié)松散顆粒而成。

圖 9 砂柱膠結(jié)實(shí)物圖(a)連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)砂柱試樣(b)間斷運(yùn)行膠結(jié)砂柱試樣

圖10 砂柱礦物的XRD圖譜

圖11 砂柱礦物的SEM圖像(a為100倍；b為4000倍)

3 結(jié)論

1)微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積可以有效地膠結(jié)砂粒，而微生物在MICP實(shí)驗(yàn)過程中扮演著至關(guān)重要的作用。當(dāng)pH為8時(shí)，細(xì)菌的生長條件達(dá)到最佳狀態(tài)，且高活性的芽孢桿菌能使MICP實(shí)驗(yàn)更有效率。

2)微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀具有顯著的砂粒膠結(jié)作用并可有效地封堵砂柱間的孔隙，從而降低砂柱的孔隙率。但經(jīng)連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)下砂柱的出水速度小于同一時(shí)間下經(jīng)間斷運(yùn)行膠結(jié)砂柱的出水速度，連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式下砂柱的孔隙封堵效果較好，得到的砂柱性能較好。

3)兩種膠結(jié)方式得到的砂柱碳酸鈣含量存在明顯的差異，連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式下不同部位的碳酸鈣含量都高于相應(yīng)部位下間斷運(yùn)行膠結(jié)的碳酸鈣含量，且不同部位的碳酸鈣含量也存有差異。對(duì)于間斷運(yùn)行膠結(jié)方式形成的砂柱，其砂柱局部性膠結(jié)，但對(duì)于連續(xù)運(yùn)行膠結(jié)方式形成的砂柱，雖然砂柱的不同部位碳酸鈣含量也存有差異，但不影響試樣表面整體性。