馮 慧， 王 璐， 馮成利

(陜西省秦嶺珍稀瀕危動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西省動(dòng)物研究所， 西安 710032)

隨著PCR和DNA測序技術(shù)的發(fā)展，物種鑒定技術(shù)從傳統(tǒng)的宏觀形態(tài)鑒別發(fā)展到依靠核酸鑒別。線粒體DNA(mtDNA)具有分子結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率快、無重組、多拷貝及嚴(yán)格的母系遺傳等特點(diǎn)[1-2]，可以敏感地區(qū)分種內(nèi)和種間DNA序列的細(xì)微差異[3-4]，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于哺乳類、鳥類、魚類和昆蟲類物種的分類。

本文對2019年6月收到的一起鳥類撞擊飛機(jī)殘?bào)w進(jìn)行形態(tài)鑒定，并選擇mtDNA細(xì)胞色素b基因(Cytb)和細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)進(jìn)行分子鑒定。通過測序得到的待測鳥類mtDNA序列和GenBank已發(fā)表序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定鳥類殘?bào)w的物種類別。探討Cytb序列和COⅠ序列作為DNA條形碼對鳥類進(jìn)行物種鑒定的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。鑒定結(jié)果可以為飛機(jī)抗撞擊實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來源于西安飛機(jī)工業(yè)公司試飛站，飛機(jī)撞擊后鳥類殘?bào)w。包括一個(gè)初級(jí)飛羽，一些帶少許肌肉的絨毛。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)殘留初級(jí)飛羽形態(tài)，參照文獻(xiàn)[5-8]，并輔助研究所內(nèi)的鳥類標(biāo)本，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 DNA提取

DNA提取采用Promega公司的動(dòng)物組織DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用手冊對鳥類殘?bào)w組織進(jìn)行全基因組DNA提取。

1.2.3 mtDNACytb序列和COⅠ序列的PCR擴(kuò)增、測序

mtDNACytb序列的PCR擴(kuò)增采用一對鳥類mtDNACytb通用引物，L14851：5′-CCTACTTAGGATCATCGCCCT-3′，H16065：5′-GTCTTCATCTCCGGTTTAC AAGAC-3′[9]；COⅠ序列的PCR擴(kuò)增采用一對鳥類mtDNACOⅠ通用引物，L6615：5′-CCTCTATAAAAAGGTCTACAGCC-3′，H7956：5′-GGGTAGTCCG AGTATCGTCG-3′[10]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

PCR反應(yīng)體積為(50 μL)：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 1.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各2.5 μL，Taq酶0.4 μL，超純滅菌水補(bǔ)齊至50 μL。Cytb序列PCR反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35循環(huán)，最后一循環(huán)72 ℃延伸10 min；4 ℃ 保存?zhèn)溆?。COⅠ序列PCR反應(yīng)體系退火溫度為44 ℃，其余條件與Cytb序列擴(kuò)增反應(yīng)體系相同。

將Cytb序列和COⅠ序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)對比

利用Chromas軟件對測序結(jié)果圖譜進(jìn)行驗(yàn)證、拼接。將拼接后的mtDNACytb基因序列和COⅠ基因序列在GenBank(網(wǎng)址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)在線數(shù)據(jù)庫，用BLAST軟件進(jìn)行在線比對分析。然后下載對比排列前10物種的基因序列，再加上哺乳動(dòng)物野豬的mtDNACytb和COⅠ序列作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

該飛羽為藍(lán)黑色具有金屬光澤，形狀狹長，長度為127 mm，對比所內(nèi)標(biāo)本后確定為金腰燕(Cecropisdaurica)，為雀形目，燕科，燕屬動(dòng)物。

2.2 擴(kuò)增結(jié)果

mtDNACytb基因擴(kuò)增后共得到965 bp序列，COⅠ基因擴(kuò)增后共得到749 bp序列。圖1為mtDNACytb基因和COⅠ基因擴(kuò)增后電泳圖。

M： Marker DL 2000; 1: Cytb; 2: COⅠ

2.3 與GenBank中序列對比結(jié)果

用BLAST軟件在線比對后，mtDNACytb基因PCR產(chǎn)物與基因庫中序列號(hào)為 GU460265.1普通家燕(Hirundorustica)的mtDNACytb序列相似度為99.48%，965 bp共有5個(gè)堿基差異。

mtDNACOⅠ基因PCR產(chǎn)物與基因庫中序列號(hào)為KP148840.1普通家燕(Hirundorustica)的COⅠ序列相似度為99.81%，749 bp共有2個(gè)堿基差異。

在GenBank對比排列前8的動(dòng)物為：安哥拉燕(Hirundoangolensis)、白喉藍(lán)燕(Hirundonigrita)、珠胸燕(Hirundodimidiata)、白喉燕(Hirundoalbigularis)、白尾燕(Hirundomegaensis)、紅額燕(Hirundoaethiopica)、線尾燕(Hirundosmithii)和喜燕(Hirundoneoxena)，相似度范圍為96.90%～94.85%。

將上述10種動(dòng)物和金腰燕(Hirundodaurica)的Cytb序列和COⅠ序列下載，同時(shí)下載鴨科大天鵝(Cygnuscygnus)和哺乳綱偶蹄目野豬(Susscrofa)的Cytb和COⅠ序列作為外群對比序列，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 基于Cytb序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹

從Cytb序列和COⅠ序列構(gòu)建的兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)生樹可以看出，檢測樣品和家燕的關(guān)系最近，聚為一枝，和金腰燕的關(guān)系比較遠(yuǎn)；檢測樣品與天鵝和野豬的關(guān)系最遠(yuǎn)。由此可以推斷，檢測樣品為家燕。

3 討論與結(jié)論

3.1 形態(tài)鑒定與分子鑒定

本次鑒定中，形態(tài)學(xué)鑒定為金腰燕，分子鑒定為家燕，聚類分析中待鑒定樣品與金腰燕的關(guān)系比較遠(yuǎn)。金腰燕與家燕外形相似，區(qū)別在于金腰燕腰部呈栗色，家燕腰部為藍(lán)黑色，翅膀長短、顏色區(qū)別不大。在本案例中，腰部羽毛缺失，僅從一根翅膀羽毛分辨，有一定誤差性。形態(tài)鑒定的局限性體現(xiàn)在：1)待鑒定樣品僅為肌肉組織、殘肢、骨頭；2)動(dòng)物發(fā)育階段不同影響，如幼體外形相似的動(dòng)物(毛冠鹿、狍子、小麂等)；3)不同生態(tài)環(huán)境下，相同基因型產(chǎn)生不同的表型變化；4)對形態(tài)鑒定人員的分類經(jīng)驗(yàn)要求較高[11]。分子鑒定的優(yōu)勢是可以準(zhǔn)確識(shí)別物種的局部組織，鑒定樣品不受物種發(fā)育階段以及個(gè)體形態(tài)特征的影響，不受物種的限制，并且有利于發(fā)現(xiàn)新種和隱存種；此外，該技術(shù)的準(zhǔn)確度高，實(shí)驗(yàn)操作簡單、不受鑒定人員經(jīng)驗(yàn)限制、易于掌握和推廣[12-14]。

但是分子鑒定也有一定的局限性。1)近源種不易區(qū)分。有些近源種的分子差異非常小，在分子鑒定時(shí)通常選用的是mtDNA保守區(qū)的通用引物，序列比對時(shí)相似性均在99%以上。如家豬、野豬、家豬和野豬的雜交品種，這幾種動(dòng)物mtDNA幾乎沒有差異，在鑒定時(shí)經(jīng)常難以區(qū)分；家犬和狼，在用mtDNA通用引物擴(kuò)增后，也無法區(qū)分，在鑒定時(shí)還需要對特有位點(diǎn)進(jìn)行檢測[15-16]。2)序列庫中無比對序列。在鑒定時(shí)通常選用NCBI數(shù)據(jù)庫或BOLD system數(shù)據(jù)庫[17-18]，這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫為開放數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，但是并不是所有物種的基因序列數(shù)據(jù)都上傳至數(shù)據(jù)庫，因此有時(shí)不能比對出正確結(jié)果。如翼手目動(dòng)物蝙蝠的數(shù)據(jù)較少，本課題組在比較時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)相似性僅有95%或更低的情況出現(xiàn)[19-20]，在鑒定時(shí)僅能鑒定至屬，不能鑒定至種。3)鑒定所需時(shí)間長。分子鑒定經(jīng)過DNA提取、PCR擴(kuò)增、DNA測序等一系列實(shí)驗(yàn)，有時(shí)還需重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能得出結(jié)論，不能滿足某些刑事案件的時(shí)限要求。

3.2 mtDNA Cytb和COⅠ基因在物種鑒定中的應(yīng)用

mtDNACOⅠ和Cytb基因相對于其他mtDNA基因和核基因來說，具有以下2個(gè)優(yōu)點(diǎn)。1)具有較高的保守性，一般通用引物可以擴(kuò)增出來；2)變異速率較高，能夠區(qū)分種間差異[14]。因此mtDNACOⅠ和Cytb基因被廣泛應(yīng)用于物種鑒定。二者比較，在種水平上的鑒定，Cytb基因和COⅠ基因得到的鑒定結(jié)果一致性較高[21]；Cytb基因比COⅠ基因進(jìn)化速率快，但COⅠ基因擁有更多的系統(tǒng)發(fā)育信號(hào)[22]，COⅠ基因更適合應(yīng)用在亞種水平的鑒定[23-25]。有的物種COⅠ基因種間差異性非常小難以區(qū)分，比如大部分的腔腸類(Cnidaria)動(dòng)物[26]，在鑒定時(shí)需要參考Cytb基因鑒定作為輔助。

3.3 種內(nèi)種間基因序列差異

雖然mtDNACOⅠ基因和Cytb基因不同物種間的進(jìn)化速率不同，但是研究發(fā)現(xiàn)大部分的物種COⅠ基因和Cytb基因的種內(nèi)個(gè)體間序列差異在1%～2%之間[27-30]。在本次實(shí)驗(yàn)中，待測樣品與普通家燕的COⅠ基因序列差異為0.19%，Cytb基因序列差異為0.52%，均在1%以下。但種間差異較大，尤其是與普通家燕外形相似，僅在腰間有一金色條帶的金腰燕，序列差異數(shù)為125個(gè)，差異率達(dá)到12.97%。這種形態(tài)差異較小，但基因序列差異較大的情況也出現(xiàn)在鲌屬魚中[31]。由此可見，雖然外形比較接近的兩種動(dòng)物上分類在同一屬的動(dòng)物其基因序列差異反而會(huì)比較大。

3.4 分子鑒定在野生動(dòng)物保護(hù)中的應(yīng)用

鑒于動(dòng)物分子鑒定的諸多優(yōu)勢，在野生動(dòng)物保護(hù)中也有很廣泛的應(yīng)用前景。1)發(fā)現(xiàn)隱存種。隱存種是指因外形相似，而基因特征差異較大的物種。形態(tài)學(xué)分類通常將其劃分為同一個(gè)物種，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展而逐步分離出來。如長頸鹿是單型種屬，有9個(gè)亞種，最新的研究發(fā)現(xiàn)有4種長頸鹿mtDNACytb基因已有明顯的遺傳分化[32]。Hebert利用mtDNACOⅠ基因研究哥斯達(dá)黎加的一種普通蝴蝶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10個(gè)隱存種[33]。隱存種的發(fā)現(xiàn)，可以更加準(zhǔn)確地評(píng)估區(qū)域生物多樣性情況，對于瀕危野生動(dòng)物針對其不同分化制定不同的保護(hù)措施[34]，對野生動(dòng)物的管理和保護(hù)有重要意義[35]。2) 野外調(diào)查時(shí)能準(zhǔn)確識(shí)別區(qū)域內(nèi)野生動(dòng)物種類。糞便是野外調(diào)查比較常見的野生動(dòng)物痕跡，有時(shí)同食性的近緣種動(dòng)物糞便相似性非常大，難以區(qū)分。如筆者所在單位在陜北進(jìn)行原麝調(diào)查時(shí)，其糞便與狍子幼體糞便難以區(qū)分；在秦嶺調(diào)查時(shí)，小型食肉類動(dòng)物糞便難以區(qū)分，如豬獾和狗獾、金貓和豹貓等。通過分子鑒定，可以準(zhǔn)確識(shí)別糞便為何種動(dòng)物，從而清晰掌握野生動(dòng)物的種類和數(shù)量，減少調(diào)查時(shí)的誤差，為野生動(dòng)物保護(hù)部門擬定相關(guān)保護(hù)規(guī)劃、起草相關(guān)法律法規(guī)提供理論依據(jù)。3)打擊野生動(dòng)物非法貿(mào)易犯罪行為。自古以來我國便有食用、藥用、衣用、飼養(yǎng)和觀賞野生動(dòng)物或其制品的傳統(tǒng)。盡管國家制定了一系列法律法規(guī)，但野生動(dòng)物盜獵、貿(mào)易等違法行為屢禁不止，危害物種生存，破壞生態(tài)平衡。許多犯罪分子為了逃避打擊，通常將野生動(dòng)物剝皮、肢解，或烘干打粉入藥，形態(tài)學(xué)難以鑒別，如不能準(zhǔn)確識(shí)別涉案樣本，會(huì)影響案件的性質(zhì)和涉案價(jià)值。分子鑒定能夠解決上述問題，為相關(guān)執(zhí)法部門提供辦案依據(jù)，為國家挽回經(jīng)濟(jì)損失。