王 蕾， 顧婷婷， 甘立軍

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 南京 210095)

在植物中，DNA甲基化主要參與了基因的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而對植物生長發(fā)育產(chǎn)生影響[1]。DNA甲基化會影響植物的生長發(fā)育、器官分化等生物過程，尤其是在植物春化作用與開花，正?；ㄆ鞴俚男纬膳c發(fā)育，內(nèi)源基因表達(dá)和轉(zhuǎn)基因植株的基因沉默等過程中有重要作用[2]。DNA甲基化主要發(fā)生在對稱的CG, CHG和不對稱CHH位點(diǎn)中(H代表A、C或T)，其中CG和CHG位點(diǎn)的甲基化是最主要的甲基化形式。DNA甲基化對植物的生長發(fā)育主要起調(diào)控作用，CG(mCG)位點(diǎn)的甲基化是在DNA復(fù)制過程中由甲基轉(zhuǎn)移酶1(Methyltransferase1, MET1)維持，是植物基因組中最豐富的DNA甲基化形式[3-4]。植物特異性染色質(zhì)域甲基轉(zhuǎn)移酶3(Chromomethylase, CMT3)主要負(fù)責(zé)CHG(mCHG)位點(diǎn)的甲基化[5-9]。域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(Domains rearranged methyltransferase, DRM)的結(jié)構(gòu)和哺乳動物的Dnmt3甲基化酶相似，對CHH非對稱位點(diǎn)的從頭甲基化及維持失活轉(zhuǎn)座子及轉(zhuǎn)基因沉默位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化進(jìn)行修飾，同時，DRM也參與RNA介導(dǎo)的甲基化過程[10-13]。

DDM1(Decrease in DNA methylation1)是一種Snf2家族的核糖體重塑蛋白，在植物體中對保持CG和非CG位點(diǎn)甲基化起著非常重要的作用[14-15]。DDM1可以通過水解ATP改變核小體的組成和位置，從而允許其他甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)入DNA[11,16]。近來的研究表明，擬南芥中DDM1的破壞導(dǎo)致異染色質(zhì)TEs和其他DNA重復(fù)序列中所有類型的DNA甲基化顯著減少[15,17-18]。除擬南芥外，ddm1突變體已在玉米和水稻中分離得到，均含有兩個ddm1同源基因，在玉米中，兩個單一T-DNA插入功能喪失的ddm1突變體顯示非CG背景下甲基化顯著降低[19]。在水稻中，功能缺失的單突變體Osddm1a和Osddm1b沒有明顯的表型，但在雙突變體中觀察到嚴(yán)重的生長缺陷，3種位點(diǎn)的甲基化都有顯著的降低[20]。為了探究DDM1基因?qū)ι植葺l(fā)育過程的影響，通過構(gòu)建草莓中DDM1基因的RNAi干擾載體，并通過草莓葉片農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因草莓，來降低草莓中DDM1基因的表達(dá)量，觀察轉(zhuǎn)基因株系的表型，從而進(jìn)行DDM1基因在草莓生長發(fā)育過程中的功能研究，這為以后研究甲基化對草莓生長發(fā)育的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

二倍體森林草莓(Fragariavesca, Ruegen F7-4)，于(25±2) ℃組培室內(nèi)培養(yǎng)，光周期為16 h/8 h(光/暗)。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105以及p2300GRN-35S-faq-nos的RNAi表達(dá)載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

KOD FX DNA聚合酶(TaKaRa)、限制性內(nèi)切酶(Thermo Fisher)、rTaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等購自Axygene公司；Infusion一步克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 正向片段DDM1-1的片段的克隆和回收

根據(jù)FveDDM1基因全長cDNA序列，利用Snapgene和Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)含有同源臂的引物，以野生型森林草莓的cDNA為模板，分別采用引物F1/R1(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得正向片段DDM1-1(412 bp)。按照KOD FX說明書進(jìn)行反應(yīng)體系配制。PCR程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；延伸溫度68 ℃，延伸時間根據(jù)擴(kuò)增片段長度來計(jì)算(1 kb/min)，最后68 ℃延伸10 min后結(jié)束，總共35個循環(huán)。使用凝膠回收試劑盒對獲取的目的片段進(jìn)行純化回收，并置于-20 ℃保存。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.2.2 中間載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶SalⅠ對p2300GNR-35S-faqr-nos的載體骨架進(jìn)行酶切后，回收載體片段。將擴(kuò)增好的含有同源臂的正向片段和回收的載體片段按照Infusion一步克隆試劑盒說明書進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中，挑取抗卡拉霉素的單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將鑒定所得陽性重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測序，連接正確的重組質(zhì)粒命名為p35S-DDM1-1-RNAi。

1.2.3 反向片段DDM1-2的擴(kuò)增和DDM1基因干涉表達(dá)載體的構(gòu)建

以中間載體p35S-DDM1-1-RNAi為模板，利用含有同源臂的引物F2/R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得反向片段DDM1-2(412 bp)。同時用XbaⅠ對中間載體進(jìn)行單酶切，進(jìn)行純化回收后，與擴(kuò)增的反向片段DDM1-2進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，同時用Hind Ⅲ和EcoRⅠ對構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，能得到1760 bp大小的條帶，說明構(gòu)建成草莓DDM1基因RNAi表達(dá)載體p35S-FveDDM1-RNAi。將測序完全正確的重組質(zhì)粒利用凍融法[21]轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，保存陽性克隆供草莓的遺傳轉(zhuǎn)化使用。

1.2.4 草莓外植體的制備

取適量飽滿的二倍體草莓的種子通過消毒滅菌后接種于含MS固體培養(yǎng)基的組培瓶中，待長成小苗后，選取葉齡35 d左右、長勢一致、葉脈清晰、葉片厚實(shí)、葉色不深的嫩葉作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。

1.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的森林草莓的遺傳轉(zhuǎn)化

在懸浮含有表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液的同時，把選作外植體的草莓葉片在背面用刀片沿垂直葉脈方向輕輕劃三刀或四刀。將切好的葉片置于復(fù)蘇好的菌液中，置于28 ℃搖床100 r/min浸染20 min。將浸染好的葉片的正面貼于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS-B5+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA+100 μmol/L AS)上，黑暗培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)入脫菌培養(yǎng)基(MS-B5+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L IBA+300 mg/L Ti)中，在弱光下培養(yǎng)15 d左右，觀察葉片是否長出愈傷，未長出愈傷的繼續(xù)脫菌，長出愈傷的外植體移至含有抗生素的篩選培養(yǎng)基(MS-B5+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+300 mg/L Ti+20 mg/L Kan)上在光下進(jìn)行篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為22 ℃，為了防止葉片褐化，每2周更換1次培養(yǎng)基。

當(dāng)有不定芽產(chǎn)生時，將不定芽進(jìn)行分離。先轉(zhuǎn)移至生芽培養(yǎng)基(MS-B5+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+300 mg/L Ti+20 mg/L Kan)中培養(yǎng)，待長出葉后將其轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基(MS-B5+0.2 mg/L IBA +300 mg/L Ti+20 mg/L Kan)中，待長成完整小苗，有3～5片真葉時，緩苗后移入花盆中。

1.2.6 GUS染色

對轉(zhuǎn)基因草莓葉片進(jìn)行GUS染色檢測，剪取轉(zhuǎn)基因草莓幼葉進(jìn)行GUS染色，以野生型草莓植株作為對照。37 ℃保溫過夜后，用無水乙醇進(jìn)行脫色，直到所取葉片的表面呈無色，顯微鏡或肉眼可以觀察到葉片邊緣組織有明顯的藍(lán)色，則表明GUS報(bào)告基因已整合到草莓基因組中，并發(fā)生了表達(dá)。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR

采用RT-qPCR方法，對轉(zhuǎn)基因草莓DDM1基因表達(dá)量進(jìn)行分析，驗(yàn)證RNAi的干擾效率。選用森林草莓的GADPH基因作為內(nèi)參基因。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR的檢測引物，其中FveDDM1基因上、下游引物序列分別為：FveDDM1-F/FveDDM1-R(見表1)。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)過軟件輸出后采用 Microsoft Excel和SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析，運(yùn)用△△CT法對基因的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。所有樣品均設(shè)置3次獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 森林草莓FveDDM1基因正向片段DDM1-1擴(kuò)增

為了構(gòu)建FveDDM1基因干涉表達(dá)載體，以森林草莓的cDNA為模板，選擇DDM1基因(GenBank登錄號：XM_004289096)上392 bp的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了該基因的一段正向片段(DDM1-1)，通過電泳分析，結(jié)果顯示所獲得的目的片段的大小和預(yù)期一致(圖 1-A)。

圖 1 正向片段DDM1-1擴(kuò)增(A)和p35S-DDM1-1-RNAi質(zhì)粒PCR檢測(B)

2.2 中間載體的構(gòu)建

將擴(kuò)增的正向片段和用SalⅠ單酶切的骨架載體進(jìn)行連接后，將連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化，涂板經(jīng)抗性篩選后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，經(jīng)電泳檢測后能擴(kuò)增出600 bp與目的片段大小一致的條帶(圖 1-B)，說明目的片段可能連接到骨架載體上面。將陽性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞測序，結(jié)果表明已成功構(gòu)建p35S-DDM1-1-RNAi中間載體，保存測序正確的重組質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 FveDDM1基因反向片段DDM1-2擴(kuò)增和干涉載體的構(gòu)建

以測序正確的重組質(zhì)粒為模板，利用反向引物F2和R2進(jìn)行擴(kuò)增得到反向片段DDM1-2(圖 2-A)，然后與用XbaⅠ單酶切的中間載體進(jìn)行一步克隆連接，再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)中，進(jìn)行Kan抗性篩選后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切檢測結(jié)果顯示片段大小與預(yù)期的大小一致(1760 bp)，見圖 2-B。將陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的測序檢測，結(jié)果顯示已成功的構(gòu)建成FveDDM1基因的干涉表達(dá)載體，載體結(jié)構(gòu)如圖 3所示。將測序結(jié)果完全正確的pFveDDM1-RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，用做森林草莓的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.4 轉(zhuǎn)基因草莓株系GUS染色鑒定

依據(jù)Jefferson等[22]的染色方法，對轉(zhuǎn)基因草莓株系進(jìn)行GUS染色檢測。分別剪取生長在MS培養(yǎng)基上的野生型和轉(zhuǎn)基因型的草莓葉片進(jìn)行GUS染色，通過脫色可以觀察到野生型植株的葉片呈現(xiàn)白色。相比之下，轉(zhuǎn)基因草莓葉片呈現(xiàn)藍(lán)色(圖 4)，表明GUS基因已經(jīng)插入到草莓的基因組中，并且進(jìn)行了表達(dá)，說明了草莓轉(zhuǎn)化成功。

M：DNA Marker DS2000。 A圖1和2：反向片段DDM1-2 ；B圖1、2和3：pFveDDM1-RNAi質(zhì)粒經(jīng)Hind III和EcoR I酶切結(jié)果

圖3 pFveDDM1-RNAi載體結(jié)構(gòu)簡圖

CK：對照(野生型)；1～7：不同轉(zhuǎn)基因株系

2.5 轉(zhuǎn)基因草莓中甲基化修飾基因FveDDM1的表達(dá)分析

WT：野生型；R1～R4，R6～R7，R9～R11：不同轉(zhuǎn)基因株系。柱狀圖中字母不同代表顯著差異(P≤0.01)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNAi的干擾效果，利用RT-qPCR對草莓轉(zhuǎn)基因株系的DDM1基因進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表示，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因草莓不同株系中FveDDM1基因的相對表達(dá)出現(xiàn)了顯著的下調(diào)(P≤0.01)(圖5)。

2.6 轉(zhuǎn)基因草莓的表型分析

經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)、脫菌、篩選及生根培養(yǎng)等過程，得到了50個獨(dú)立株系的FveDDM1的RNAi轉(zhuǎn)基因材料，并且已觀察到了相應(yīng)的表型，F(xiàn)veDDM1沉默植株葉片出現(xiàn)了明顯的畸形，葉邊緣變窄，缺刻變深(圖6)，各個RNAi株系果實(shí)的表型正在觀察中。以上現(xiàn)象表明DNA甲基化對草莓的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。

WT：野生型；FveDDM1：RNAi的轉(zhuǎn)基因草莓

3 討論與結(jié)論

近年來，RNA干擾技術(shù)發(fā)展迅速，由于其能特異并高效的抑制特定基因的正常表達(dá)，降低目的基因的表達(dá)量，同時還可以進(jìn)行多代穩(wěn)定遺傳，因此逐漸成為植物基因功能研究的重要遺傳學(xué)手段[23]。而RNAi技術(shù)的關(guān)鍵在于選擇目標(biāo)基因構(gòu)建高效的RNA干擾表達(dá)載體。之前的研究表明，所用的基因RNAi片段在98到853 bp時都能對基因的表達(dá)起到很好的抑制效果(抑制效率可達(dá)到90%)[24-25]。Wlesley等[26]發(fā)現(xiàn)在目的基因的正向片段和反向片段之間插入一個內(nèi)含子，可以顯著提高正義鏈和反義鏈RNA形成雙鏈RNA的效率，有利于產(chǎn)生siRNA。在本研究中為了獲得較好的干涉效果，所使用的載體在啟動子下游的多克隆位點(diǎn)中間包含一個128 bp的內(nèi)含子，這與胡旭霞和劉耀光[27]在水稻基因RNA干涉載體的設(shè)計(jì)一致，同時我們所用的RNAi片段長度為392 bp。因此，本研究在進(jìn)行載體構(gòu)建時采用了較為理想的實(shí)驗(yàn)方案。

先前的研究表明，DNA甲基化對植物形態(tài)的建成和發(fā)生有很大影響，甲基化的缺失去引起植物一系列異常的表型[3-4]。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，F(xiàn)veDDM1基因在草莓葉片上具有較高的表達(dá)[28]，表明該基因?qū)Σ葺~片的生長發(fā)育可能起著重要作用。本研究中我們通過構(gòu)建FveDDM1基因的沉默載體，來降低FveDDM1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FveDDM1-RNAi的轉(zhuǎn)基因株系，F(xiàn)veDDM1基因在草莓葉片中的表達(dá)量明顯降低，并且草莓葉片出現(xiàn)了明顯的異常表型，比如葉邊緣變窄，缺刻變深。因此，我們推測FveDDM1甲基化基因在維持草莓葉片的正常形態(tài)中起著重要作用。