王 越， 胡 澍， 汪欣怡， 張明炎， 蔣 豫

(河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 洛陽 471003)

原神經(jīng)模式是果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要機(jī)制之一，原神經(jīng)基因的特異性表達(dá)引起蛋白產(chǎn)物的累積，通過Notch 信號(hào)通路介導(dǎo)的側(cè)向抑制催生并確定神經(jīng)前體細(xì)胞(Neural progenitor cells，NPC)，而后NPC經(jīng)過增殖分化形成各類神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，最終構(gòu)成了復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)，原神經(jīng)基因?qū)ι窠?jīng)發(fā)生起著決定性作用[1-3]。tap基因可能具有原神經(jīng)基因功能，通過原神經(jīng)模式調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞分化，賦予神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞各自獨(dú)有的特征，而參與果蠅神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程[4]。

果蠅tap基因，也稱為biparous，由兩個(gè)研究小組分別針對mec-3和delilah兩個(gè)基因的bHLH結(jié)構(gòu)域，通過低保真度雜交和PCR篩選鑒定而來。其序列全長約2.13 kb，物理定位于3號(hào)染色體左臂，細(xì)胞遺傳學(xué)定位于74A5[5-6]。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)tap堿基序列與脊椎動(dòng)物的neurogenin(ngn)和neuroD的序列相似度最高。三者被視為直系同源基因。從功能角度看，脊椎動(dòng)物ngn表現(xiàn)出原神經(jīng)基因的特征，在脊椎動(dòng)物中始動(dòng)了神經(jīng)發(fā)生過程。neuroD通常作為原神經(jīng)蛋白的下游基因，調(diào)節(jié)神經(jīng)分化過程[7]。而作為它們的同源基因，果蠅tap基因的功能及表達(dá)模式尚未知。

利用具有時(shí)間、空間特異性的啟動(dòng)子界定GAL4 的表達(dá)，后者能立即結(jié)合UAS序列，使得UAS序列控制下的目標(biāo)基因的表達(dá)呈現(xiàn)與啟動(dòng)子相同的時(shí)空特異性[8-9]。本實(shí)驗(yàn)利用已有的tapGal4品系(tap基因的編碼序列被Gal4基因的編碼序列準(zhǔn)確取代[10])雜交后得到基因型為tapGal4/UAS-GFP的胚胎、蛹、幼蟲、成蟲，進(jìn)行GFP免疫熒光染色，展示tap在果蠅發(fā)育過程的表達(dá)模式，為研究tap基因的功能和調(diào)控提供時(shí)空依據(jù)。此項(xiàng)研究不僅豐富了對神經(jīng)bHLH蛋白家族功能的認(rèn)識(shí)，也為脊椎動(dòng)物ngn同類研究提供參照依據(jù)。通過tap和ngn兩者功能的系統(tǒng)比對，明確同一基因在不同物種發(fā)育中功能與調(diào)控的異同，并從進(jìn)化層面加以探索解釋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

tapGal4品系由胡澍在比利時(shí)魯汶大學(xué)Bassem Hassan實(shí)驗(yàn)室攻讀博士學(xué)位時(shí)制備，所有權(quán)歸該實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)中使用的其他品系則訂購于美國bloomington果蠅品系中心。

1.1.2 試劑

免疫熒光一抗：大鼠抗Elav；兔抗GFP，小鼠抗22C10；小鼠抗Repo；小鼠抗Pros；小鼠抗-24B10購自Developmental Studies Hybndoma Bank(DSHB)；小鼠抗視紫紅質(zhì)3(Rh3)(單克隆，由Steven G.Britt，University of Colorado，USA提供)；

熒光二抗：山羊抗兔488；山羊抗大鼠655;山羊抗小鼠555購自北京博奧森生物。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

激光共聚焦顯微鏡(Leica DM-RXA)；體視顯微鏡(Motic SMZ168)；高速冷凍離心機(jī)(SIGMA3K15)；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱中科美菱(DW-HW50)；四維旋轉(zhuǎn)混勻器其林貝爾(BE-1100)。

1.2 方法

1.2.1tap在果蠅胚胎、幼蟲、蛹、成蟲各階段表達(dá)模式的測定

果蠅胚胎免疫熒光染色：收集果蠅胚胎，將胚胎用0.2%PBT溶液沖洗3遍，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.2%PBT洗3次，每次20 min， PAXDG室溫封閉胚胎1 h后，加入一抗 (用PAXDG稀釋到工作濃度)，4 ℃過夜。再加入所需二抗，室溫孵育1 h。二抗結(jié)束后，0.2%PBT洗4次，每次20 min。最后加入Vectashield封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

果蠅幼蟲免疫熒光染色：將果蠅三期幼蟲固定于1×PBS的解剖盤中，用解剖鑷子固定果蠅幼蟲頭部，另一只手拿解剖鑷子于幼蟲第二、三結(jié)處夾住表皮，從頭向尾部撕下幼蟲表皮，剝離出大腦與成蟲盤，放入固定液中室溫固定20 min，結(jié)束后0.3%PBST洗3次，每次15 min，室溫封閉1 h，再加入所需的一抗稀釋至工作濃度，室溫或4 ℃過夜。一抗結(jié)束，用0.3%PBST洗3次，每次15 min，再加所對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，洗去二抗，蓋玻片封片，激光共聚焦下觀察，拍照。

果蠅蛹期免疫熒光染色：將適齡果蠅蛹放入2%多聚甲醛室溫預(yù)固定10 min，除去外殼，破壞蛹的外皮，以便固定液更好地固定樣品，再把解剖好的樣品放入2%多聚甲醛室溫固定1 h； 0.2%PBT洗3次，每次15 min，PAXDG室溫封閉1 h，一抗4℃過夜，熒光二抗避光孵育2 h，封片后激光共聚焦下進(jìn)行觀察拍照。

果蠅成蟲免疫熒光染色：將CO2麻醉后的果蠅放入1×PBS中，用解剖鑷子將果蠅頭部與身子分離，剝離頭部外骨骼和白色纖維，保持大腦完整；將解剖好的樣品放入固定液中室溫固定,之后的步驟與果蠅蛹期免疫熒光染色相同。染色結(jié)束后在激光共聚焦下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.2tap基因在復(fù)眼發(fā)育中的動(dòng)態(tài)表達(dá)的測定

選擇三齡期幼蟲作為解剖對象，將其浸泡于PBS中并拉出眼一觸角成蟲盤，立即放入PBS清洗。用4%多聚甲醛固定20 min，PAXD透化2次，每次20 min，PAXDG封閉20 min，加入所需一抗4 ℃過夜孵育，次日室溫二抗避光孵育1 h，PAXDG, PAXD, PBS室溫依次洗10 min。再用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗2次，每次15 min，蓋玻片封片，激光共聚焦下拍照。

分別選擇三期幼蟲發(fā)育30、50和70 h轉(zhuǎn)變而成的蛹作為解剖對象，免疫熒光觀察tap在不同蛹階段復(fù)眼發(fā)育的表達(dá)模式。

1.2.3 果蠅tap在成蟲大腦的表達(dá)模式的測定

選擇成蟲果蠅大腦為樣品，4%多聚甲醛固定30 min，PAXDG室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜，熒光二抗避光孵育2 h。封片后激光共聚焦觀察拍照。

1.2.4 純合tapGal4在胚胎時(shí)期的表達(dá)測定

收集基因型為tapGal4/TM6B-Ubi-GFP的胚胎。Ubi-GFP是果蠅平衡品系的顯性標(biāo)記物，其在果蠅組織中普遍存在GFP信號(hào)。選出喪失該顯性標(biāo)記的純合的tap突變胚胎(tapGal4/tapGal4)。通過對果蠅胚胎時(shí)期GFP，Elav和22C10免疫染色觀察純合tapGal4的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 tap在果蠅胚胎階段表達(dá)模式

在tapGal4與UAS-CD8-GFP雜交后的子代中，通過GFP信號(hào)間接展示tap在果蠅胚胎時(shí)期的表達(dá)模式。從胚胎第13期開始，可觀察到tap在果蠅中樞神經(jīng)大腦，腹部神經(jīng)索和周圍神經(jīng)節(jié)神經(jīng)束中廣泛表達(dá)(圖1)。

2.2 通過免疫熒光染色觀察果蠅tap在幼蟲、蛹和成蟲不同時(shí)期的表達(dá)模式

tap在果蠅三期幼蟲時(shí)期的腹部神經(jīng)索和大腦有廣泛表達(dá)(圖2-a)。蛹和成蟲階段，逐漸局限于中腦和視葉，特別在成蟲蘑菇體和中樞復(fù)合體中有廣泛表達(dá)(圖2-b、c)。

a：tap在腹部神經(jīng)索和周圍神經(jīng)節(jié)神經(jīng)束中廣泛表達(dá)；b：在大腦廣泛表達(dá)，觸角復(fù)合體(箭頭)和Bolwig器官(箭頭)中可見表達(dá)信號(hào)；c：顯示tap在側(cè)向脊索器官(箭頭)的表達(dá)，其形態(tài)易識(shí)別(連續(xù)5個(gè)神經(jīng)元排成一行)。果蠅胚胎頭部位于所有照片的上方

a：tap(綠色)在三期幼蟲中腦和視神經(jīng)中廣泛表達(dá)；b：tap(綠色)在蛹期的中腦和視神經(jīng)中廣泛表達(dá)；c：tap(綠色)在視神經(jīng)大量表達(dá)，特別是成蟲中的蘑菇體和中央復(fù)合體

a：tap(綠色)在三期幼蟲的眼盤后緣R7細(xì)胞中表達(dá)；b：在蛹發(fā)育初始階段的眼盤后緣的R7細(xì)胞中的表達(dá)tap(綠色)；c：30%蛹階段tap(綠色)在眼成蟲盤的表達(dá)；d、e：50%蛹階段tap(綠色)在蛹發(fā)育50 h視網(wǎng)膜后部的R7細(xì)胞中表達(dá)情況；f：tap(綠色)在蛹發(fā)育70 h視網(wǎng)膜前部區(qū)域的R7細(xì)胞中表達(dá)，此時(shí)也在觸角有表達(dá)

2.3 tap在復(fù)眼發(fā)育中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式

在果蠅三期幼蟲階段，tap在眼成蟲盤最后緣R7光感受器中有特異性地表達(dá)(圖3-a)。在蛹階段，tap表達(dá)在復(fù)眼的所有R7細(xì)胞中(圖3-c)。在蛹階段晚期，tap表達(dá)從眼部向觸角移動(dòng)(圖3-f)。R7細(xì)胞中的tap表達(dá)呈現(xiàn)由復(fù)眼后緣向前緣劃過的瞬態(tài)波，然后開始在觸角中表達(dá)。

2.4 tap在成蟲大腦的表達(dá)模式

解剖成蟲果蠅大腦，利用免疫熒光對GFP，Elav(神經(jīng)原細(xì)胞標(biāo)記物)和Repo(神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物)免疫染色，結(jié)果顯示在中腦和視神經(jīng)葉中的GFP信號(hào)僅與Elav共定位，表明tap僅在神經(jīng)元中有表達(dá)，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)(圖4-a)；中腦軸突中的GFP與Elav共定位(圖4)表明tap在神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)。

2.5 純合tapGal4突變體在胚胎時(shí)期的表達(dá)結(jié)果

通過免疫熒光染色13期純合tapGal4/tapGal4胚胎，以及同一發(fā)育時(shí)期的野生型胚胎。染色對比后，清楚可見前者藍(lán)色標(biāo)識(shí)的神經(jīng)元胞體分布無序，說明此時(shí)大量神經(jīng)元胞體缺失。再比較兩者腹部神經(jīng)索的發(fā)育，純合子tap變異體的神經(jīng)元形態(tài)、軸突分布及排布無一是完整的(以圖5-b野生型為對照)，導(dǎo)致死亡。而對雜合tapGal4/balancer::ubi-GFP品系胚胎免疫熒光染色，可清楚地看到發(fā)育正常的神經(jīng)元軸突樹突(圖5-b)。由此可以進(jìn)一步判斷，純合tapGal4/tapGal4在胚胎期致死。

a：純合的tap突變體(tapGal4 /tapGal4)導(dǎo)致嚴(yán)重的軸突缺失及發(fā)育異常；b：對照組(tapGal4/balancer::ubi-GFP)為正常的神經(jīng)元軸突和樹突生長和分布

3 討論與結(jié)論

通過對比堿基序列相似度，果蠅tap基因被認(rèn)定為脊椎動(dòng)物ngn基因的直系同源基因，且編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白。ngn家族由ngn1、ngn2和ngn3三個(gè)亞族構(gòu)成，均在神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，體現(xiàn)出明顯的原神經(jīng)基因特性，進(jìn)而作為轉(zhuǎn)錄因子參與神經(jīng)細(xì)胞增殖與分化等過程。哺乳動(dòng)物ngn1和ngn2可在神經(jīng)發(fā)育早期的端腦皮質(zhì)腦室?guī)е斜磉_(dá)。ngn2是一種特異性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)發(fā)育過程中控制神經(jīng)元的命運(yùn)，促進(jìn)神經(jīng)元分化[11]，ngn1、ngn2與E47等結(jié)合形成異源的二聚體，然后與特定的DNA序列作用，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)，進(jìn)而決定著神經(jīng)元的特性和分型[12]。tap基因是果蠅體內(nèi)唯一的ngn同源基因，編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白。通過對純合tapGal4/tapGal4胚胎免疫熒光染色，可觀察到13期果蠅胚胎神經(jīng)軸突缺失及發(fā)育異常，神經(jīng)元軸突分布無一是完整的，導(dǎo)致胚胎死亡。說明tap是果蠅神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育不可缺失的基因。本實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光染色技術(shù)，檢測tapGal4/ UAS-GFP子代的GFP信號(hào)，間接地追蹤tap在果蠅不同的發(fā)育階段的表達(dá)。在果蠅胚胎時(shí)期、幼蟲時(shí)期及蛹期的中樞神經(jīng)、周圍視神經(jīng)均有廣泛表達(dá)，特別是成蟲果蠅的大腦海馬體及中央復(fù)合體、視神經(jīng)中有特異性表達(dá)，這與脊椎動(dòng)物ngn在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有重要作用是一致的，能給脊椎動(dòng)物ngn的相關(guān)研究提供參考和借鑒。

ngn基因的突變、缺失會(huì)引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌2型糖尿病和新生兒糖尿病等[13-14]。最新發(fā)現(xiàn)ngn1是內(nèi)耳中毛細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生至關(guān)重要的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子[15]。ngn3不僅在人和小鼠的神經(jīng)組織中表達(dá)，也是胚胎早期胰島發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，在胰腺細(xì)胞的分化和命運(yùn)決定中起重要作用[16-17]，是胰腺和腸道內(nèi)分泌譜系形成所必需的[18]。這表明ngn不僅在脊椎動(dòng)物的大腦神經(jīng)系統(tǒng)有重要作用，同時(shí)對其他器官的發(fā)育和功能也有調(diào)節(jié)作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)ngn在眼部器官的相關(guān)報(bào)道，有趣的是，本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光染色GFP,可清楚地觀察到tap在三期幼蟲視網(wǎng)膜后緣R7光感受細(xì)胞中特異性地表達(dá)，表明tap對果蠅復(fù)眼的發(fā)育有重要影響，但具體作用機(jī)制尚未明確。對此的進(jìn)一步研究有可能豐富對神經(jīng)bHLH蛋白家族功能的認(rèn)知。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用Gal4系統(tǒng)和果蠅免疫熒光染色技術(shù)[19], 對tap基因在果蠅不同發(fā)育階段，即胚胎、幼蟲、蛹和成蟲4類樣本中GFP的染色，系統(tǒng)地描繪出tap在果蠅發(fā)育過程中的表達(dá)模式。這為后續(xù)該基因的功能與調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)也有不足之處，因?yàn)橐恢蔽茨艹晒χ苽鋞ap特異性抗體，只能利用tapGal4/UAS-GFP間接地描繪tap的表達(dá)模式。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將繼續(xù)嘗試制備tap特異性抗體，以及對tap基因的功能和調(diào)控進(jìn)行深入的研究。